Kiinteän{0}}faasipeptidisynteesin (SPPS) perusperiaatteet ja työnkulku

Kiinteän{0}}faasin peptidisynteesi (SPPS)on menetelmä peptidien syntetisoimiseksi kiinteällä alustalla. Tärkeimmät SPPS-strategiat sisältävätBoc-menetelmäjaFmoc-menetelmä. Peptidisynteesi on toistuva peräkkäisen aminohappolisäyksen prosessi, ja se suoritetaan yleensäC-pää (karboksyylipää)kohtaanN-pää (aminopää). Ensin kohdepeptidin ensimmäisen aminohapon karboksyyliryhmä kiinnitetään kovalenttisesti kiinteään kantajaan (hartsiin). Käyttämällä tämän aminohapon aminoryhmää lähtökohtana N--terminaalinen suojaryhmä poistetaan ja kasvavaa peptidiketjua pidennetään reagoimalla ylimäärän kanssa aktivoitua toista aminohappoa. Tämä sykli-kytkentä → pesu → suojauksen poisto → neutralointi ja pesu → seuraava kytkentä- toistetaan, kunnes haluttu peptidin pituus on saavutettu. Lopuksi peptidiketju katkaistaan ​​hartsista ja puhdistetaan kohdepeptidin saamiseksi. Kun -aminoryhmä on suojattuBoc (tert-butyylioksikarbonyyli), menetelmää kutsutaan nimelläBoc{0}}pohjainen kiinteän-faasin peptidisynteesi. Kun -aminoryhmä on suojattuFmoc (9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli), se tunnetaan nimelläFmoc{0}}pohjainen kiinteän{1}}faasin peptidisynteesi.

 

Boc-pohjainen kiinteä{1}}faasipeptidisynteesi (Boc-menetelmä)

VuonnaBoc-menetelmä, Boc-ryhmät voidaan poistaa trifluorietikkahapolla (TFA)käytetään suojaamaan -aminoryhmiä, kun taasbentsyyli{0}}tyyppisiä suojaryhmiäkäytetään sivuketjuissa. Synteesin aikana Boc-suojattu -aminohappo liitetään ensin kovalenttisesti hartsiin. Boc-ryhmä poistetaan sitten TFA:lla ja tuloksena oleva vapaa aminopää neutraloidaan trietyyliamiinilla. Seuraava aminohappo aktivoidaan käyttämälläDCC (disykloheksyylikarbodi-imidi)ja kytketty pidentämään peptidiketjua. Kokoonpanon päätyttyä kohdepeptidi lohkaistaan ​​hartsista käyttämällä vahvaa happoa, tyypillisestivedetön fluorivety (HF)taitrifluorimetaanisulfonihappo (TFMSA)Boc-synteesimenetelmässä tarvitaan toistuvia happokäsittelyjä suojaavien ryhmien poistamiseksi ennen jokaista kytkentävaihetta. Tämä voi johtaa useisiin sivureaktioihin, kuten peptidin ennenaikaiseen lohkeamiseen hartsista ja aminohapposivuketjujen epästabiilisuuteen happamissa olosuhteissa, mikä johtaa ei-toivottuihin sivureaktioihin.

 

Fmoc{0}}pohjainen kiinteä-faasipeptidisynteesi (Fmoc-menetelmä)

sisään1978, Meienhofer ja Athertonkehitti peptidisynteesistrategian käyttämälläFmoc (9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli)-aminosuojaryhmänä, joka tunnetaan nimelläFmoc-menetelmä. Tässä lähestymistavassa -aminoryhmä suojataanbase{0}}labiili Fmoc, kun taas sivuketjut on suojattuhappo-labiilit Boc--tyyppiset suojaryhmät.Fmocin suuri etu amino-suojaryhmänä on senstabiilisuus happamissa olosuhteissa; siihen ei vaikuta käsittely reagensseilla, kutentrifluorietikkahappo (TFA)ja ne voidaan poistaa valikoivasti käyttämällämieto pohja. Samanaikaisesti sivu-ketjun suojaryhmät, kuten Boc, ovat stabiileja emäksissä ja ne poistetaan happamalla käsittelyllä. Lopuksi peptidi lohkaistaan ​​kvantitatiivisesti hartsista käyttämälläTFA/dikloorimetaani (DCM), välttäen vahvojen happojen käyttöä ja parantaen siten turvallisuutta ja yhteensopivuutta rutiininomaisen peptidisynteesin kanssa.

 

Kiinteän{0}}faasipeptidisynteesin (SPPS) kehityshistoria

1. Perustusvaihe (1900-luvun alusta vuoteen 1963)

sisään1902, Emil Fischeroli ensimmäinen, joka tutki peptidisynteesiä, mutta edistyminen oli hidasta teknisten rajoitusten vuoksi. Varhaiset synteesit käytössäbentsoyyli- ja asetyylisuojaryhmät, joita oli vaikea poistaa ja jotka usein johtivatpeptidiketjun katkaisu.

sisään1932, Max Bergmannja työtoverit esittelivät{0}}bentsyylioksikarbonyyli (Z) -ryhmä-aminosuojaryhmänä. Tämä ryhmä voidaan poistaa altakatalyyttinen hydraus tai happamat olosuhteet, joka tarjoaa luotettavamman työkalun peptidisynteesiin ja loi perustan kiinteän -faasin peptidisynteesin kehitykselle 1960-luvulla.

aikana1950s, tutkijat onnistuneesti syntetisoivat erilaisiabiologisesti aktiiviset peptidit, kutenoksitosiini ja insuliini. Nämä saavutukset lisäsivät peptidikemiaa ja loivat pohjan kiinteän -faasin peptidisynteesin syntymiselle.

 

2. Pioneering Stage (1963)

sisään1963, Robert B. Merrifieldehdottikiinteä{0}}faasipeptidisynteesi (SPPS) -menetelmä, jossaC-terminaalinen aminohappoon ankkuroitu hartsikantajaan ja peptidiketju pidennetään toistuvien syklien kauttasuojauksen poisto ja kytkeminen. Tämä lähestymistapa yksinkertaisti suuresti peptidisynteesiprosessia ja siitä tulisuositeltava menetelmäpeptidien kokoamista varten.

Merrifield käytettyBoc (tert-butyylioksikarbonyyli)-aminoryhmän suojaamiseksi. 1960-luvun lopulla hän kehitti myösensimmäinen täysin automatisoitu peptidisyntetisaattorija syntetisoitu onnistuneestibiologiset proteiinitkutenribonukleaasi (124 aminohappoa). Näistä uraauurtavista saavutuksista Merrifield palkittiinNobelin kemian palkinto vuonna 1984.

 

3. Teknologinen innovaatiovaihe (1972)

sisään1972, Lou Carpinokehittänyt9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli (Fmoc) suojaryhmä, joka voi ollapoistetaan varovasti perusolosuhteissa, vähentää sivureaktioita. Tämä teki siitä erityisen sopivankompleksiset peptiditjaautomatisoitu synteesi.

TheFmoc-menetelmävähitellen korvasi Boc-menetelmän valtavirran strategiana. Automaattiset peptidisyntetisaattorit, jotka perustuvat molempiinFmoc ja Boc kemiaMyöhemmin kehitettiin, mikä ajaapeptidisynteesin automatisointija parantaa huomattavasti tehokkuutta ja toistettavuutta.

 

4. Kypsyys- ja laajennusvaihe (1990-luvulta tähän päivään)

Hartsin ja reagenssin optimointi:Kehittäminenkorkea-kuormitus, hydrofiiliset PEG-muokatut hartsitja tehokkaat kytkentäreagenssit, kutenHBTUjaHATUon parantanut merkittävästi kiinteän{0}}faasipeptidisynteesin (SPPS) tehokkuutta ja saantoa.

Teknologinen integraatio:Uudet lähestymistavat mmmikroaalto{0}}avusteinen synteesijavirtauskemiaovat lyhentäneet reaktioaikoja ja lisänneet saantoja entisestään.

 

SPPS:n perusperiaatteet ja työnkulku:
Kiinteän{0}}faasin peptidisynteesin ydinperiaate onpeptidiketjun vaiheittainen rakentaminen kiinteälle alustalle, käyttämälläsuojella ryhmästrategioitajakondensaatio (kytkentä) reaktiotsaavuttaatehokas ja hallittava peptidikokoonpano.

1. Kiinteän kantajan (hartsin) rooli kiinteässä{1}}faasipeptidisynteesissä (SPPS)

A liukenematon polymeerihartsi-kutenpolystyreeni-divinyylibentseeni-silloitettu hartsi, Wang-hartsi tai Rink-amidihartsi- on valittu SPPS:n kiinteäksi tueksi. Hartsipinta sisältääfunktionaalisia ryhmiä(esim. hydroksyyli- tai aminoryhmät), jotka voivat muodostuakovalenttiset sidokset peptidiketjun toiseen päähän, yleensäC-pääte, ankkuroi peptidin kiinteään alustaan. Tämä kovalenttinen kiinnitys varmistaa, että kasvava peptidipysyy sitoutuneena hartsiin koko synteesin ajan, mikä suurestihelpottaa myöhempiä reaktiovaiheita, pesua ja puhdistusta

 

2. Ryhmästrategian suojaaminen kiinteässä-faasipeptidisynteesissä (SPPS)

Peptidisynteesin aikana-aminoryhmä, karboksyyliryhmä ja reaktiivisen puolen-ketjun funktionaaliset ryhmätaminohapot (kuten tioli, karboksyyli ja aminoryhmät) ovat alttiitasivureaktioita. Näiden ei-toivottujen reaktioiden estämiseksi,suojaryhmiäkäytetään. Yleisiä suojaryhmiä ovat:-Aminosuojaryhmät:

Boc (tert-butyylioksikarbonyyli):Happo-labiili, helposti poistettavahappamissa olosuhteissa.

Fmoc (9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli):Stabiili happamissa olosuhteissa, voidaan poistaa alleperusehdot(esim. piperidiini/DMF-liuos).Sivu{0}}ketjun suojaryhmät:Valitaan aminohapposivuketjun kemiallisten ominaisuuksien mukaan.yleisiä ryhmiä ovat mmbentsyyli (Bn), tert-butyyli (tBu), trityyli (Trt)jne. Nämä ryhmät ovatpoistetaan synteesin lopussa, yleensä peptidin katkaisun aikana hartsista, käyttämällähappoa tai muita erityisiä olosuhteita.

 

3.C-Terminus - N-Terminus synteesi SPPS:ssä

sisäänkiinteä{0}}faasipeptidisynteesi (SPPS), peptidien kokoaminen alkaa yleensä kloC-pää (karboksyylipää)ja etenee vaiheittain kohtiN-pää (aminopää). Tämä johtuu siitä,C-terminaalinen aminohappo kiinnitetään ensin kiinteään kantajaan, ja seuraavat aminohapot on kytkettypeptidiketjun vapaa aminoryhmä, joka on jo sitoutunut hartsiinpidentää vähitellen peptidiketjua.

 

4. Kytkentäreaktio kiinteässä-faasipeptidisynteesissä (SPPS)

Suojattujen aminohappojen on oltavaaktivoituniin että heidänkarboksyyliryhmät muuttuvat reaktiivisiksi, jolloin ne voivat muodostaa apeptidisidoshartsiin{0}}sidotun peptidin aminoryhmän kanssa. Yleistäaktivoivat reagenssitsisältääkarbodi-imidit(esim. DCC, DIC),HOBt, HATU, jaPyBOP. Kun karboksyyliryhmä on aktivoitu, se reagoi vapaan aminoryhmän kanssa kohdassa akondensaatioreaktio, muodostaen anamidisidosja siten kiinnittämällä uuden aminohapon kasvavaan peptidiketjuun.

 

5. Toistuvat (sykliset) toiminnot kiinteässä{1}}faasipeptidisynteesissä (SPPS)

Prosessi sisältäätoistamalla suojauksen poisto → kytkentä → pesu, lisäämälläyksi aminohappo sykliä kohdenpeptidiketjun asteittain pidentämiseksi. Jokaisen jälkeenkytkentäreaktio, hartsi onpesty(esim. liuottimilla, kuten DMF tai DCM) poistamaan reagoimattomat reagenssit, sivutuotteet ja ylimääräiset aminohapot. The-äskettäin lisätyn tähteen aminoryhmästä poistetaan sitten suojaus, paljastaen vapaan amiinin valmistautumaan seuraavaan kytkentäreaktioon. Tätä sykliä toistetaan, kunnes haluttu peptidisekvenssi on koottu kokonaan.

 

6. Pilkkominen kiinteässä-faasissa peptidisynteesi (SPPS)

Kun peptidiketju on saavuttanut halutun pituuden, se onirronnut kiinteästä alustastakäyttämällä sopivaa reagenssia samanaikaisestipoistamalla kaikki suojaryhmät. Yleisesti käytetty katkaisureagenssi ontrifluorietikkahappo (TFA), joka ei vainkatkaisee sidoksen peptidin ja hartsin välillävaan myöspoistaa suojaryhmätkuten Fmoc ja Boc, palauttaen peptidin siihensyntyperäinen osavaltio. Kun peptidiketju on saavuttanut halutun pituuden, se onirronnut kiinteästä alustastakäyttämällä sopivaa reagenssia samanaikaisestipoistamalla kaikki suojaryhmät. Yleisesti käytetty katkaisureagenssi ontrifluorietikkahappo (TFA), joka ei vainkatkaisee sidoksen peptidin ja hartsin välillävaan myöspoistaa suojaryhmätkuten Fmoc ja Boc, palauttaen peptidin siihensyntyperäinen osavaltio.

Näiden vaiheiden kauttakiinteä{0}}faasipeptidisynteesi (SPPS)mahdollistaapeptidiketjujen tehokas ja kontrolloitu kokoaminen kiinteälle alustallevälttää monimutkaiset välipuhdistusvaiheet, joita vaaditaan perinteisessä liuos{0}}faasisynteesissä ja merkittävästisynteesin tehokkuuden ja tuoton parantaminen.

Näiden vaiheiden kauttakiinteä{0}}faasipeptidisynteesi (SPPS)mahdollistaapeptidiketjujen tehokas ja kontrolloitu kokoaminen kiinteälle alustallevälttää monimutkaiset välipuhdistusvaiheet, joita vaaditaan perinteisessä liuos{0}}faasisynteesissä ja merkittävästisynteesin tehokkuuden ja tuoton parantaminen.