Kuinka valita sopiva ultrasuodatusputki

Ultrasuodatusputkissa käytetään usein proteiinien väkevöintiin ja puskurin korvaamiseen yleisesti käytettyjä ultrasuodatusputkia. On muitakin malleja, joilla on erilaiset tilavuuskoot ja ultrasuodatusputket, riippuen kohdeproteiinin molekyylipainosta, tilavuudesta ennen konsentraatiota ja pitoisuuden tavoitetilavuudesta. Uudelleenkäytettävä.

1. Valitse sopiva ultrasuodatusputki ottaen huomioon pääasiassa MWCO ja pitoisuustilavuus. Yleensä molekyylipainon ei tulisi olla suurempi kuin 1/3 kohdeproteiinin molekyylipainosta. Jos kohdeproteiinin molekyylipaino on noin 10 kd, voidaan käyttää ultrasuodatusputkea, jonka molekyylipaino on 3 KD.

2. Äskettäin ostettu ultrasuodatin on kuiva. Lisää milliq vettä ennen käyttöä. Vesi kulkee kokonaan kalvon läpi ja esijäähdytetään jäähauteessa tai jääkaapissa muutaman minuutin ajan. Kaada sitten vesi pois proteiiniliuoksen lisäämiseksi. Proteiiniliuoksen määrä ei saa ylittää koeputken päällä olevaa valkoista viivaa. Helppokäyttöinen. Ennen proteiiniliuoksen lisäämistä ultrasuodatusputki on asetettava jäähän esijäähdytystä varten.

3. Tasapaino. Massan ja painopisteen tulee olla tasapainossa. Huomaa, että nopeus ja kiihtyvyys eivät saa olla liian nopeita, muuten ultrasuodatuskalvo vaurioituu suoraan. Aloita keskipakoultrasuodatus (esijäähdyttämällä sentrifugi 4 asteeseen). Kalvon ja pyörivän akselin suuntaa voidaan säätää ohjeiden mukaan (kulmasentrifugissa kalvo on kohtisuorassa akseliin nähden). Varsinaisessa käytössä yleinen nopeus on pienempi kuin ohjekirjassa ilmoitettu, mikä voi pidentää keskipakoputken käyttöikää.

4. Kun se on väkevöity jäljellä olevaan 1 ml:aan, [ota 50 ul:n kotitalouksien Bradford-liuosta, lisää 10 ul nestettä nähdäksesi, muuttuuko se siniseksi, ja määritä, vuotaako ultrasuodatusputki proteiinia. Jos putki vuotaa, kaada se ylempään kerrokseen ja virtaa sitten takaisin uuteen putkeen ultrasuodatuksen aloittamiseksi. Määrittääksesi tarkasti, vuotaako koeputki, sentrifugoi 5 mg 10 minuuttia 10 minuuttia, vie se sitten läpi, käytä proteiinigeeliä tai Bradfordia [karkea mittaus]. Jatka jäljellä olevan proteiiniliuoksen lisäämistä konsentroimiseksi (toimi jäällä estääksesi proteiinin kuumenemisen), kunnes kaikki väkevöidyt liuokset on lisätty. Kiinnitä sentrifugoinnin aikana huomiota siihen, tapahtuuko proteiinin saostumista ja aiheuttaako se putken tukkeutumisen. Jos saostuu, määritä saostumisen erityinen syy, onko proteiinipitoisuus liian korkea vai onko puskuri sopimaton; Edellinen voidaan ratkaista käyttämällä useita ultrasuodatusputkia samanaikaisesti pitoisuuden vähentämiseksi, kun taas jälkimmäinen voi vaihtaa erilaisia ​​puskureita, kunnes proteiini saostuu.

5. Edellisiä vaiheita käytetään proteiinin konsentroimiseen. Jos puskuri on vaihdettava, kun kokonaisproteiiniliuos on konsentroitu noin 1 ml:ksi, lisää varovasti uusi puskuri (ultrasuodatus 0,22um ultrasuodatuskalvon läpi) ja konsentroi sitten jatkuvasti noin 1 ml:ksi kolme kertaa, joten että lopullinen pitoisuus riippuu vaaditusta proteiinipitoisuudesta, joka ei yleensä ole yli 500 ul tai alle 200 ul. Joka kerta vähintään 10-kertaisen tilavuuspitoisuuden mukaan se on yli 1000 kertaa kolminkertainen, mikä voi periaatteessa saavuttaa puskurin vaihtamisen tarkoituksen.

6. Poista lopullinen proteiinikonsentraatti. Toimi jäällä. Työnnä pipetin kärki varovasti reunaa pitkin keltaisella pipetin kärjellä (200 ul) ja puhalla sitten kevyesti ja sekoita proteiiniliuos. Varo koskettamasta ultrasuodatuskalvoa. Ime tiivistettyä liuosta 200 ul:aan joka kerta, kunnes se on imeytynyt kokonaan. Viimeistä tiivistettyä liuosta ei tarvitse poistaa koeputken pohjalta, muuten se on liian vaikeaa ja ultrasuodatuskalvo voi vaurioitua. Lopuksi ultrasuodatusputkeen lisätään milliq vettä ilman, että se kulkee ultrasuodatuskalvon läpi vedenhäviön ja kalvon kuivumisen estämiseksi.

7. Seuraavat ovat vaiheet ultrasuodatusputken käsittelyä ja ultrasuodatusputken uudelleenkäyttöä varten.

8. Kaada vettä ultrasuodatusputkeen ja huuhtele varovasti milliq vedellä useita kertoja. [jos koeputken pohjassa on selvää proteiinisaostumista, voit lisätä ensin vettä ja puhaltaa sen sitten pois pipetillä. Varo koskettamasta kalvoa. Sedimentti roikkuu alas ja juoksee sitten pois. Sitä ei voi huuhdella vesijohtovedellä. Kun olet lisännyt 0,2 m NaOH-liuosta, aseta se huoneenlämpötilaan 20 minuutiksi ja tasapainota ultrasuodatusputkea tänä aikana. Sentrifugoi vielä 10 minuuttia. Kaada jäljelle jäänyt NaOH-liuos ja upota puuvillasydän dekantterilasiin (1 tai 2 l) Milliq-veteen, sijoitetaan useiksi tunteiksi ja korvataan sitten uudella vedellä, laitetaan useiden tuntien ajaksi jatkuvasti laimentamaan NaOH-pitoisuutta. Pese 50 ml koeputki ja peitä se vesijohtovedellä ja pese sisäseinä milliq vedellä.

9. Ota pois upotettu koeputken ydin, lisää se täyteen milliq vettä ja täytä sitten 50 ml koeputki milliq vedellä. Laita putken ydin hitaasti 50 ml:aan.

Sentrifugoi putki, valuta ja jaa vesi, peitä ja säilytä 4 asteessa seuraavaan käyttöön asti. Yleisesti ottaen edellä olevien vaiheiden ja varotoimien mukaan kukin putki ei katkea kolmen tai neljän vuoden kuluessa.