MRNA-lääkkeiden valmistusprosessin täydellinen analyysi: Kuinka TFF-tekniikka ratkaisee puhdistushaasteet

Viime vuosina mRNA-teknologia on saavuttanut läpimurtoa biofarmaseuttisella alalla, mikä osoittaa valtavan sovelluspotentiaalin erityisesti rokotteissa ja geeniterapiassa. Onnistunut mRNA-rokotteiden kehitys ei ole tarjonnut vain uusia ratkaisuja tartuntatautien ehkäisyyn ja valvontaan, vaan se on myös edistänyt syövän immunoterapian ja yksilöllisen lääketieteen kehitystä. Uutena terapeuttisten tuotteiden luokkana laajamittainen mRNA:n valmistus on erittäin haastavaa. Se sisältää RNA:n stabiilisuuden hallinnan, entsyymien jäännösten poistamisen ja tuotteiden sivureaktion, puskurinvaihdon ja korkean-puhtausasteen saavuttamisen, mikä kaikki edellyttää valmistusteknologioita ja säädöstenmukaisia-ratkaisuja.

mRNA-rokotteiden tai terapeuttisten aineiden valmistusprosessi jakautuu pääosin kolmeen vaiheeseen: plasmidi-DNA-bulkkiliuoksen valmistus, mRNA-bulkkiliuoksen valmistus ja mRNA-LNP-lääketuotteen valmistus.

mRNA-lääkkeiden valmistusprosessin vuokaavio

 

Tangentiaalivirtaussuodatusta (TFF), joka on vakiintunut -kalvoerotustekniikka, käytetään laajasti mRNA:n valmistuksessa sen tehokkaan-molekyyliseulontakyvyn, hallittavan puskurinvaihdon ja alhaisten leikkausjännitysominaisuuksien ansiosta. Kalvomoduulirakenteen perusteella yleiset TFF-kokoonpanot sisältävät litteät-arkkikasetit ja ontot{4}}kuitumoduulit. Lisäksi TFF:n paine{6}}ohjattu kalvoerotus voidaan luokitella mikrosuodatukseen (MF), ultrasuodatukseen (UF), nanosuodatukseen (NF) ja käänteisosmoosiin (RO) kalvon huokoskoon mukaan, ja selektiivisyys kasvaa asteittain.

 

TFF:llä on kriittinen rooli mRNA-lääkevalmistuksen useissa vaiheissa, mukaan lukien plasmidi-DNA-bulkin valmistus, mRNA-bulkkituotanto ja mRNA-LNP-lääketuotteiden lopullinen formulointi. Kalvotyypin, molekyylipainoraja{1}}(MWCO) ja kalvomateriaalin asianmukaisella valinnalla TFF mahdollistaa reaktion sivu-tuotteiden ja pieni-molekyylipainoisten-epäpuhtauksien tehokkaan poistamisen sekä helpottaa puskurin vaihtoa ja pitoisuutta sekä ennen LNP-kapselointia että sen jälkeen. Tämä parantaa merkittävästi RNA:n puhtautta, vakautta ja yleistä prosessin skaalautuvuutta.

 

Lisäksi tangentiaalisen virtauksen suodatuksen suorituskykyyn vaikuttavat järjestelmän kokoonpanotekijät, kuten pumpun tyyppi ja putkien rakenne, sekä keskeiset prosessiparametrit, kuten transmembraanipaine (TMP), leikkausjännitys ja suodatusvirta. Nämä tekijät on valittava huolellisesti ja optimoitava kohdetuotteen ominaisuuksien perusteella, erityisesti stressiherkissä tuotteissa, kuten mRNA-LNP, jotka ovat erittäin herkkiä ulkoisille mekaanisille voimille käsittelyn aikana.

 

Plasmidi-DNA:n puhdistus

Plasmidi-DNA-varastoliuoksen valmistus perustuu pohjimmiltaan transkriptiotemplaatin sekvenssisuunnitteluun. Valmistusmenetelmät sisältävät tyypillisesti plasmidi-DNA:n monistamisen, vaikka PCR-monistusta voidaan myös käyttää. Esimerkkinä DNA-monistus, suunniteltuE. colikäytetään yleisesti käymis{0}}pohjaiseen vahvistukseen. Alavirran puhdistusprosessi sisältää pääasiassa solujen keräämisen, lyysin ja kirkastamisen, väkevöinnin ja puskurinvaihdon, steriilisuodatuksen, linearisoinnin ja kromatografisen puhdistuksen. Teollisissa olosuhteissa jatkuvaa -virtaussentrifugointia käytetään usein solujen keräämiseen, mutta se tuottaa suhteellisen suuria leikkausvoimia. Onttokuitujärjestelmät avoimilla kanavillaan ja pienellä leikkausvoimalla sopivat paremmin sellaisten näytteiden käsittelyyn, joissa on korkea kiintoainepitoisuus, korkea viskositeetti tai leikkausherkkyys, kuten plasmidi-DNA. Keräyksen jälkeen solut alistetaan korkeapainehomogenisaatiolle, ultraäänikäsittelylle tai emäksiselle lyysille, mitä seuraa alustava selkeytys syväsuodatuksella.

 

Myöhemmän kromatografian helpottamiseksi käytetään usein ensin väkevöintiin ja puskurinvaihtoon tangentiaalista virtaussuodatusta (TFF), jossa käytetään kalvokasetteja tai onttoja kuitupylväitä, joiden molekyylipainoraja on 30 kDa, 100 kDa tai 300 kDa. Tämä pienentää näytetilavuutta ja samalla poistaa jotkin epäpuhtaudet, kuten RNA:n, isäntäsoluproteiinit (HCP) ja isäntäsolun DNA-fragmentit (HCD). Kromatografia toimii ytimen puhdistusvaiheena. Tyypillisesti anioninvaihtokromatografia (AEX) yhdistetään hydrofobiseen vuorovaikutuskromatografiaan (HIC) epäpuhtauksien poistamiseksi tehokkaasti ja erittäin bioaktiivisen superkierteisen plasmidi-DNA:n rikastamiseksi, mikä parantaa merkittävästi plasmidin puhtautta.

 

Puhdistuksen jälkeen plasmidi altistetaan uudelleen TFF:lle liuoksen väkevöimiseksi tavoitepitoisuuteen (yleensä 0,5–2 mg/ml) ja dialyysin suorittamiseksi lopullisella säilytyspuskurilla. Tämä vaihe poistaa jäännössuolat ja orgaaniset liuottimet prosessista varmistaen, että puskurijärjestelmä täyttää alavirran in vitro -transkriptioreaktioiden (IVT) vaatimukset.

 

In vitro -transkriptoidun (IVT) mRNA:n puhdistus

In vitro -transkriptio (IVT) ja modifiointi ovat mRNA-varastoliuosten valmistuksen avainprosesseja. IVT-mRNA-tuotannon aikana käytetään yhdistelmää tangentiaalista virtaussuodatusta (TFF1) – kromatografiaa – tangentiaalivirtaussuodatusta (TFF2). Tämä strategia varmistaa mRNA:n tehokkaan ja korkealaatuisen-puhdistuksen ja tarjoaa kriittistä tukea rokotteiden valmistukseen.

Kun transkriptio- ja modifiointireaktiot on suoritettu loppuun, ultrasuodatus/diasuodatus suoritetaan tyypillisesti ensin käyttämällä kalvokasetteja tai onttoja kuitupylväitä, joiden molekyylipainorajat ovat 30 kDa, 100 kDa tai 300 kDa. Tämä vaihe poistaa tehokkaasti erilaisia ​​prosessiin liittyviä epäpuhtauksia reaktiojärjestelmästä, kuten RNA-polymeraasin, jäännös-DNA-fragmentit, reagoimattomat NTP:t, capping-entsyymit, kaksoisjuosteisen RNA:n (dsRNA) ja pienmolekyyli-inhibiittorit, samalla kun saavutetaan puskurinvaihto. Yhden tangentiaalivirtaussuodatusvaiheen jälkeen useimmat epäpuhtaudet poistetaan tehokkaasti, ja ainoa havaittavissa oleva jäännösproteiiniepäpuhtaus on RNA-polymeraasi.

Sen jälkeen käytetään useita kromatografiatekniikoita lisäpuhdistukseen. Yleisesti käytettyjä menetelmiä ovat affiniteettikromatografia, koko-ekskluusiokromatografia, ioni-parikäänteis-faasikromatografia ja ionin-vaihtokromatografia. Tämän ultrasuodatuksen ja peräkkäisen kromatografian yhdistelmän avulla mRNA saavuttaa korkean puhtaustason.

 

Formulaatio- tai varastointivaatimusten täyttämiseksi mRNA-varastoliuos väkevöidään tai laimennetaan uudelleen käyttämällä 30 kDa:n, 100 kDa:n tai 300 kDa:n kalvokasetteja tai onttoja kuitupylväitä kohdepitoisuuden säätämiseksi tarkasti ja vaihtamiseksi lopulliseen formulaatiopuskuriin. Lopuksi käytetään steriiliä-luokan suodatusta mikrobikuormituksen hallitsemiseksi, mikä viimeistelee materiaalin väliaikaisen varastoinnin ja täytön.

Exploration of TFF-related process parameters: Relevant studies have shown that a membrane with a molecular weight cut-off (MWCO) of 100 kDa provides the optimal purification efficiency; the transmembrane pressure (TMP) should not exceed 5 psi; and an mRNA concentration of 1 mg/mL ensures a relatively high permeate flux (>25 LMH).

 

mRNA{0}}LNP-formulaatioiden puhdistus

Lipidinanohiukkaset (LNP:t) ovat tällä hetkellä laajimmin tutkittu jakelujärjestelmä mRNA-terapeuttisille aineille. Tällä hetkellä erilaiset mRNA{1}}LNP-formulaatiot ovat prekliinisen ja kliinisen kehityksen eri vaiheissa. LNP:t ovat erittäin herkkiä valmistusprosesseille. MRNA-LNP-tuotannon edellyttämien yksikkötoimintojen joukossa merkittäviä haasteita ovat konsentraatio ja puskurinvaihto tangentiaalivirtaussuodatuksen (TFF) avulla sekä steriilisuodatus. Nämä vaiheet on optimoitava huolellisesti prosessin skaalautuvuuden ja tuotteen laadun varmistamiseksi välttäen samalla sellaisia ​​ongelmia kuin kalvon likaantumista ja suodattimen virheellistä kuormitusta.

 

mRNA:n kapseloinnin jälkeen puhdistukseen käytetään tangentiaalista virtaussuodatusta (TFF). Tämän vaiheen tarkoituksena on poistaa kapseloimaton mRNA, vapaat polymeerit tai lipidimateriaalit sekä jäännösliuottimet mRNA:sta ja lipideistä. Koska mRNA-LNP:t osoittavat rajoitettua stabiilisuutta huoneenlämpötilassa, loppupään prosessien, mukaan lukien TFF:n, optimointi on ratkaisevan tärkeää tuotteen laadun ylläpitämiseksi.

Tärkeimmät optimointiohjeet ovat: Transmembraanisen paineen (TMP) ja tangentiaalisen virtausnopeuden oikea asettaminen mRNA{0}}LNP:n hiukkaskoon ja stabiilisuuden perusteella suodatustehokkuuden ja hiukkasrasituksen tasapainottamiseksi; valitaan kalvoja tai onttoja kuitupylväitä sopivilla molekyylipainorajoilla (MWCO, esim. 100 kDa tai 300 kDa) vapaan mRNA:n, epäpuhtauksien ja vaihtopuskurin poistamiseksi tehokkaasti samalla kun minimoidaan hiukkasten adsorptio tai vaurioituminen; ja väkevöinti- ja diasuodatustilavuuksien optimointi tehokkaan puskurinvaihdon varmistamiseksi kohdeformulaatioon ja lopullisen hiukkaskonsentraation ja dispergoitumisen kontrolloimiseksi.

 

Lisäksi kriittisiä laatuominaisuuksia (kuten partikkelikokoa, polydispersiteettiindeksiä [PDI] ja mRNA:n kapseloinnin tehokkuutta) on seurattava tarkasti prosessin aikana ja parametreja on säädettävä dynaamisesti reaaliaikaisten tietojen perusteella vakaan, skaalautuvan ja tehokkaan mRNA{1}LNP:iden puhdistamisen ja formuloinnin saavuttamiseksi.

 

Lisäksi, koska mRNA{0}}LNP:t ja niiden komponentit ovat epävakaita terminaalisissa sterilointimenetelmissä, 0,2 µm:n steriiliä -laatuista suodatinta käytetään tyypillisesti bakteerien ja muiden mikrobikontaminanttien poistamiseen.