Teollinen-Nautaeläinten tarttuvan rinotrakeiitti (IBR) -rokotteen loppuvaiheen puhdistusprosessi – "Ultrasuodatus" -osio

Naudan tarttuva rinotrakeiitti (IBR) johtuu naudan tarttuvan rinotrakeiittiviruksen (IBRV) infektiosta, joka tunnetaan myös nimellä naudan herpesvirus tyyppi 1 (BHV-1). Taudille ovat pääosin tyypillisiä hengitystieoireet ja abortti. Näiden kliinisten oireiden lisäksi IBR voi johtaa lypsykarjan maidontuotannon alenemiseen ja lihanaudan painonnousuun, mikä johtaa merkittäviin taloudellisiin tappioihin kotieläintiloille.

Tauti on luonteeltaan immuunivastetta heikentävä. Kun se esiintyy yhtenä infektiona, sen patogeenisyys on suhteellisen alhainen; kuitenkin, kun esiintyy sekainfektioita muiden virus- tai bakteerisairauksien kanssa, vakavuus ja haitat lisääntyvät merkittävästi. Rokotus on tehokkain tapa ehkäistä ja torjua, sillä saatavilla on kaksi päätyyppiä rokotteita: elävät heikennetyt rokotteet ja inaktivoidut rokotteet. Tällä hetkellä tiloilla käytettävät naudan tarttuvan rinotrakeiittirokotteet ovat pääasiassa inaktivoituja rokotteita.

Eläville heikennetyille rokotteille on ominaista vahva immunogeenisyys, nopea immuniteetin muodostuminen ja pitkä suojan kesto (yleensä yli kuusi kuukautta). Niitä käytetään yleisesti hätärokotuksiin taudinpurkauksen aikana. Niihin liittyy kuitenkin mahdollisia viruksen leviämisriskejä, ne aiheuttavat riskejä tiineille lehmille, eikä niitä voida käyttää piilevän tartunnan saaneilla, mutta oireettomilla nautaeläimillä.

Inaktivoiduille rokotteille on ominaista korkea turvallisuus, eikä niissä ole riskiä viruksen leviämisestä tai virulenssin palautumisesta, ja niitä pidetään täysin turvallisina. Niitä voidaan käyttää nautakarjassa kaikissa vaiheissa, mukaan lukien tiineille lehmille, vasikoille ja siitossonnille. Immuniteetin muodostuminen on kuitenkin suhteellisen hidasta ja suojan kesto lyhyempi, joten tehosterokotukset ovat yleensä tarpeen. Joissakin tapauksissa suojateho voi olla heikompi kuin elävien heikennettyjen rokotteiden.

Riippumatta siitä, käytetäänkö elävää heikennettyä rokotetta vai inaktivoitua rokotetta, jatkopuhdistusprosessi voidaan jakaa neljään päävaiheeseen: talteenotto ja selkeytys → väkevöinti ja ensisijainen puhdistus → kiillotuspuhdistus → inaktivointi/steriili suodatus ja formulointi.

Väkevöinti on keskeinen vaihe rokotteiden jatkopuhdistusprosessissa välittömästi kirkastamisen jälkeen. Sen ensisijainen tavoite on vähentää nopeasti talteen otettu suuri-tilavuus, pieni-pitoisuudeltaan viruskirkastettu liuos pieneen-tilavuuksiseen, korkean pitoisuuden-muotoon samalla kun viruksen bioaktiivisuus säilyy. Tämä luo tarvittavat olosuhteet myöhemmille korkean erotuskyvyn- mutta pienen-kapasiteetin hienopuhdistusvaiheille, kuten kromatografialle.

Tämä vaihe suoritetaan tyypillisesti käyttämällä tangentiaalivirtausultrasuodatusta (TFF). Periaate on seuraava: virussyöttöliuos virtaa yhdensuuntaisesti tietyn huokoskoon omaavan ultrasuodatuskalvon pinnan kanssa. Paineen alaisena pienet molekyylit, kuten vesi, suolat ja tietyt epäpuhtaudet, kulkevat kohtisuorasti kalvon läpi ja poistuvat, kun taas ehjät viruspartikkelit, jotka ovat paljon suurempia kuin kalvon huokoset, säilyvät, kierrätetään jatkuvasti ja konsentroidaan. Perinteiseen nopeaan-sentrifugointiin verrattuna tämä menetelmä on hellävaraisempi hauraille viruksille, kuten IBRV, joilla on lipidivaippa. Se vähentää tehokkaasti suurten leikkausvoimien aiheuttamia virusten rakenteellisia vaurioita ja aktiivisuuden menetystä, ja se soveltuu paremmin lineaariseen-mittakaavaan teolliseen tuotantoon.

Onnistunut keskittyminen on paljon enemmän kuin pelkkä tilavuuden vähentäminen. Prosessin optimoinnin avainkohtia ovat: kalvon läpi kulkevan paineen ja syöttövirtauksen tarkka säätö suodatustehokkuuden tasapainottamiseksi minimoiden samalla konsentraatiopolarisaatio ja kalvon likaantuminen; sopivan kalvomateriaalin ja huokoskoon valitseminen korkean viruksen retention ja permeaattivirtauksen varmistamiseksi; ja löytää optimaalinen tasapaino viruksen toipumisen, pitoisuustekijän ja käsittelyajan välillä. Konsentroitu virussuspensio ei ainoastaan ​​saavuta merkittävästi korkeampaa tiitteriä, vaan se saavuttaa myös alustavan puhdistuksen poistamalla suuren osan vesiliukoisista epäpuhtauksista. Tämä tarjoaa tarvittavan tilavuuden ja konsentraatioperustan myöhemmille kriittisille jalostusvaiheille, kuten kromatografialle ja nukleaasikäsittelylle, mikä tekee konsentraatiosta keskeisen tehokkuuden keskuksen koko jatkoprosessissa.

Toissijainen diasuodatus on kriittinen vaihe rokotteen puhdistuksessa, joka sijoitetaan hienopuhdistuksen jälkeen ja ennen formulointia. Se suoritetaan tyypillisesti kromatografian ja nukleaasikäsittelyn jälkeen. Sen ydintarkoituksena ei ole alkupitoisuus, vaan järjestelmän vaihto ja lopullisten formulaatio-olosuhteiden tarkka säätö. Prosessi suoritetaan tangentiaalivirtausultrasuodatusjärjestelmässä (TFF), jossa tuoretta, puhdasta formulaatiopuskuria lisätään jatkuvasti kiertävään väkevään virusliuokseen samalla kun alkuperäinen liuotin ja pienimolekyyliset epäpuhtaudet poistetaan. Tämä toimenpide poistaa tehokkaasti ja hellävaraisesti puhdistusprosessista jääneet suolat, orgaaniset liuottimet, nukleaasien hajoamistuotteet ja vähäiset liukoiset epäpuhtaudet.

Tärkeintä on säilyttää vakiotilavuus tai tehdä pieniä pitoisuuksia sen varmistamiseksi, että viruspitoisuus vastaa formulaation vaatimuksia. Hauraille vaipallisille viruksille, kuten naudan tarttuva rinotrakeiittivirus (IBRV), sekundaarisen diafiltraation lempeä hydrodynaaminen ympäristö on ratkaisevan tärkeä partikkelin eheyden ja immunogeenisyyden säilyttämiseksi. Viime kädessä tämä vaihe tarjoaa vankan perustan myöhemmälle inaktivoinnille (tarvittaessa), adjuvantin tai stabilisaattorin lisäämiselle ja lopulliselle täytölle varmistaen, että lopputuote saapuu formulaatioon määritellyillä komponenteilla, yhtenäisillä olosuhteilla ja hyvällä yhteensopivuudella. Siksi se on yksi keskeisistä vaiheista rokotteen turvallisuuden, stabiilisuuden ja erien -to{4}}yhdenmukaisuuden varmistamisessa.

IBRV on vaipallinen, kaksijuosteinen lineaarinen DNA-virus, jonka vaippa on suunnilleen pallomainen. Kypsät IBRV-hiukkaset ovat halkaisijaltaan noin 160–230 nm. Vastaavasti 100, 300 tai 500 kDa:n ultrasuodatuskalvojen käyttö voi säilyttää IBRV:n samalla kun se poistaa joitakin kontaminoivia proteiineja. Jiuling Technology -kalvokasettien ultrasuodatuksen talteenottoaste vaihtelee syöttömateriaalin mukaan, mutta on yleensä 90–95 %.