Kalvotekniikka ja rokotteen selkeytys (Ⅰ)
Rokotteet tulevat useista eri lähteistä, mukaan lukien kudosuutteet, bakteerisolut, viruspartikkelit, proteiinit ja nisäkkään yhdistelmä-DNA-solujen, hiiva- ja hyönteissolujen tuottamat nukleiinihapot.
Yleisin rokotteen valmistusmenetelmä perustuu alkukäymiseen, jota seuraa puhdistus. Rokotteen valmistus on monimutkainen prosessi, joka sisältää monia erilaisia vaiheita ja prosesseja. Oikean puhdistusmenetelmän valinta on ratkaisevan tärkeää lopputuotteen halutun puhtauden saavuttamiseksi. Rokotteiden selkeyttäminen on tärkeä vaihe, jolla on merkittävä vaikutus tuotteen talteenottoon ja myöhempään puhdistukseen. Rokotteiden selkeyttämiseen voidaan käyttää useita tekniikoita. Keräysmenetelmän ja -laitteiden valinta riippuu akun tyypistä, kerättävän tuotteen laadusta ja prosessinesteestä. Näihin tekniikoihin kuuluu kalvosuodatus (mikrosuodatus, tangentiaalinen virtaussuodatus), sentrifugointi ja syväsuodatus (normaalivirtaussuodatus). Pitkän kokemuksen perusteella rokotesadon kirkastus saavutetaan yleensä sentrifugoimalla ja sen jälkeen syväsuodatuksella.
Viime vuosina kalvopohjaiset tekniikat ovat nousseet esiin rokotteen selkeytyksessä. Alkupään prosesseissa käytetään yhä enemmän kertakäyttöteknologioita, joten korjuustrategioita on muutettava. Tämä artikkeli tarjoaa kattavan yleiskatsauksen erilaisista kalvopohjaisista teknologioista ja niiden sovelluksista rokotteen selkeytyksessä.
01 Johdanto
Rokotteet ovat keskeinen osa tartuntatautien ehkäisyä, jotka ovat edelleen järkyttävä kuolinsyy. Rokotuksen ansiosta 2–3 miljoonaa ihmistä pelastuu joka vuosi kurkkumätältä, tetanukselta, hinkuyskältä ja tuhkarokkolta. Rokotteet kattavat laajan valikoiman pienistä rekombinanttiproteiineista kokonaisiin viruspartikkeleihin ja kokonaisiin bakteereihin. Niitä voidaan tuottaa erilaisilla järjestelmillä: munat, nisäkässolut, bakteerit jne. Rokotteiden monimutkaisuuden ja monimuotoisuuden vuoksi tällä hetkellä ei ole olemassa yleistä puhdistusprotokollaa tai mallia, vaikka kiinnostus rokotealustoja kohtaan on kasvanut.
Tyypillisesti rokoteprosessi voidaan jakaa kolmeen osaan: ylävirtaan (tuotanto ja selkeytys), jälkikäsittelyyn (puhdistus, mukaan lukien ultrasuodatus, kromatografia ja kemiallinen käsittely) ja formulointi (lopullinen täyttö). Tuotantojärjestelmästä riippumatta selkeytys (ei-toivottujen aineiden ensimmäinen poisto) on avainasemassa kestävän puhdistusprosessin määrittämisessä. Asianmukainen selkeytysvaihe poistaa pääasiassa kokonaisia soluja, solujätteitä, kolloideja ja suuria aggregaatteja vähentääkseen jatkokäsittelyn taakkaa. Joissakin tapauksissa selkeytys voi myös vähentää liukenemattomia epäpuhtauksia, isäntäsoluproteiineja (HCP) ja isäntäsolun nukleiinihappoja. Kuten mikä tahansa muu puhdistusvaihe, kirkastusvaihe on optimoitava maksimaalisen tuotteen saannon ja puhtauden saavuttamiseksi samalla kun se mukautuu rokotteen spesifisyyteen ja tuotantorajoituksiin.
Rokotetyyppien heterogeenisyyden vuoksi kirkastukseen käytetään erilaisia tekniikoita, mukaan lukien sentrifugointi tai suodatus (taulukko 1).
Useita toimenpiteitä tarvitaan yleensä halutun selkeyden saavuttamiseksi. Ensimmäinen toimenpide on suunniteltu poistamaan suurempia hiukkasia (primäärinen selkeytys) ja toinen toimenpide on suunniteltu poistamaan kolloideja ja muita submikronisia hiukkasia (toissijainen selkeytys). Hidas sentrifugointi toimii kertaluonteisena kirkastusvaihtoehtona, jolloin solut ja solujätteet voidaan poistaa saostamalla. Sentrifugointi pystyy käsittelemään suuria kiinteitä kuormia, ja sitä on käytetty laajasti erä- tai jatkuvatoimisessa tilassa ja levysentrifugeissa. Se vaatii suuria pääomainvestointeja ja ylläpitokustannuksia, ja sen skaalaamisessa on haasteita luotettavan skaalausmallin puutteen vuoksi. Jotkut kaupalliset rokotevalmistajat käyttävät kuitenkin sentrifugeja laajamittaisessa tuotannossa, johon liittyy suuria käsittelymääriä ja enemmän tuotantotoimintoja.
Selkeytyssuodatus voidaan suorittaa normaalilla virtaussuodatuksella (NFF, joka tunnetaan myös nimellä umpikujasuodatus) tai tangentiaalisella virtaussuodatuksella (TFF, joka tunnetaan myös nimellä ristivirtasuodatus). On myös erityisiä suodatintiloja (syväsuodattimia), jotka sisältävät positiivisesti varautuneita materiaaleja ja suodattimen AIDSia, jotka parantavat solujätteen, kolloidien ja negatiivisesti varautuneiden ei-toivottujen komponenttien pidättymistä.
Kalvosuodattimet pidättävät hiukkaset koon poissulkemisen perusteella, eikä niillä ole suurta liansitomiskykyä, joten ne soveltuvat toissijaisiin selkeytysvaiheisiin. Sekä syväsuodattimet että kalvosuodattimet on helppo skaalata ja toteuttaa (yksinkertainen järjestelmäsuunnittelu). Toisin kuin NFF, TFF:ää käytetään pääasiassa primääriselkeytykseen (mikrosuodatukseen). Kalvoja, joiden raja-alue on 0.1-0,65 μm (mieluiten avoimella kanavalla), on käytetty menestyksekkäästi solujen, solujätteiden ja muiden suurten kontaminanttien säilyttämiseen. Useimmat TFF-laitteet ovat lineaarisesti skaalautuvia ja uudelleenkäytettäviä puhdistuksen jälkeen, mikä vähentää merkittävästi vaiheen kulutustarvikkeiden kustannuksia.
Selkeytysvaihe on ylävirran ja alavirran prosessien välissä, ja joskus se jätetään huomiotta rokoteprosessin kehittämisessä, koska aika ja resurssit asetetaan etusijalle muille puhdistusvaiheille, kuten kromatografialle tai tiheysgradienttisentrifugoinnille.
Jopa rokotteiden valmistusprosessien patenteista jää usein pois selvennysvaihe. Selkeytysteho vaikuttaa suoraan loppupään prosessin suorituskykyyn. Huonosti optimoitu kirkastusvaihe voi vaikuttaa negatiivisesti steriloidun suodattimen kapasiteettiin tai lyhentää kromatografisen hartsin käyttöikää. Nykyään tiukemmat lainsäädännölliset odotukset saavat rokotevalmistajat tuottamaan puhtaampia, hyvin karakterisoituja mutta edullisia rokotteita. Tässä tapauksessa jokaiseen vaiheeseen on kiinnitettävä sen ansaitsemaa huomiota. Nykyiset suuntaukset viittaavat siihen, että ylävirran prosessi on siirtymässä kohti "puhtaampaa" ilmentämisjärjestelmää (eli seerumittomassa väliaineessa viljellyt solut korvaavat munat), jonka tuottavuus ja solutiheys ovat lisääntyneet.
Lopputuloksen puhdistusprosesseja yksinkertaistetaan ja virtaviivaistetaan lopputuotteen puhtauden lisäämiseksi. Selvitysvaihe ei voi muodostua pullonkaulaksi näiden muutosten käsittelemiseksi. Tässä tapauksessa suodatustekniikka vastaa uuteen selkeytyshaasteeseen, jossa käsitellään lisääntynyttä prosessin joustavuutta, kertakäyttömahdollisuutta ja alentuneita investointikustannuksia.
02 Virusrokotteiden selventäminen
Useita erityyppisiä selkeytysmenetelmiä, joko yksinään tai yhdistelmänä, on käytetty menestyksekkäästi sadon kirkastamiseen rokotteiden rehupäässä.
Pilottivaaka:1-20L, tuotantomittakaava: yli 20L
2.1 Varotoimet virusrokotteen selkeyttämiseksi
Monet rokotteet sisältävät kaikki viruspartikkelit tai osan niistä muodostaen immuniteetin virusinfektiota vastaan. Ne jakautuvat yleensä neljään laajaan luokkaan:
Elävä heikennetty rokote (LAV), joka perustuu heikennettyyn viruskantaan sen virulenssin vähentämiseksi. Heikennetyt virukset voivat lisääntyä kehossa, mutta ne eivät ole patogeenisiä.
- Inaktivoidut virusrokotteet (IV), jotka sisältävät kemiallisesti tai ultraviolettisäteilyllä inaktivoituja viruksia tarttuvuuden poistamiseksi. Viruspartikkelit voivat olla täydellisiä, jaettuja tai puhdistettuja (vain antigeeniset proteiinit).
- Virusvektorirokote (VV) on aktiivinen, ei-patogeeninen virus, joka esittelee patogeenisen viruksen antigeenin. Näitä hiljattain kehitettyjä rakenteita käytetään myös geeniterapiasovelluksissa.
Virus-like particles (VLPs) -rokotteet, erityinen virusalayksikkörokotteiden luokka, jotka jäljittelevät viruspartikkelien yleistä rakennetta, mutta eivät sisällä tarttuvaa geneettistä materiaalia.
Useimmissa tapauksissa viruspartikkelit ovat täysin ehjät selkeytysvaiheen aikana, jopa virusrokotteen lyysin aikana (katkaisu suoritetaan yleensä alavirtaan, puhtaammassa ympäristössä).
Viruksen selkeyttämisen suurin haaste on saada talteen korkeasaantoiset viruspartikkelit samalla kun se poistaa tehokkaasti solujätteet, suuret aggregaatit ja liukenemattomat kontaminantit. Kuten seuraavissa osissa kuvataan, on useita tekijöitä, jotka voivat aiheuttaa viruksen hajoamista tai häviämistä. Lisäksi virussaantoon voi olla vaikea luottaa, koska viruksen kvantitatiiviset määritysmenetelmät vaihtelevat suuresti tässä prosessin vaiheessa, erityisesti LAV- ja VV-rokotteiden osalta. Näille rokotteille virussaanto arvioidaan usein käyttämällä tarttuvuustestejä, kuten plakkitestiä tai TCID 50 -testiä. Se tosiasia, että jotkin kerätyistä yhdisteistä voivat häiritä viruksen kykyä infektoida osoitussoluja, lisää tämän kvantitatiivisen lähestymistavan vaihtelua.
2.2 Virusrokotteen selvitysstrategia
Virusrokotteet vaihtelevat suuresti koon, rakenteen, muodon ja ilmentämisjärjestelmien suhteen (taulukko 3).
Tämän seurauksena sen loppupään prosesseille, erityisesti selkeytysvaiheille, ei yleensä ole mallia. Teoriassa kaikki käytettävissä olevat tekniikat (hidas sentrifugointi, mikrosuodatus TFF, NFF) voidaan valita ja mahdollisesti yhdistää viruksen selkeyttämiseksi. Itse asiassa kirkastusmenetelmien onnistumiseen vaikuttavat ekspressiojärjestelmä ja mukana olevien virusten fysikaalis-kemialliset ominaisuudet.
Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>{0}} solua /ml) kationisia polymeerejä käyttävä selkeytysmenetelmä pienensi syväsuodatusaluetta 4 kertaa perinteisiin menetelmiin verrattuna. Tämä tekniikka mahdollistaa suurikapasiteettisten fermentoreiden keräämisen ilman sentrifugeja. Vastaavasti Riske et ai. osoitti, että 40 litran soluviljelmien (0,02 %) kitosaanikäsittely, jotka sisälsivät 1.4-2,6 % kiintoainetta, johti 7-kertaiseen absoluuttisen suodattimen kapasiteetin kasvuun syväsuodatuksen jälkeen.
He mainitsevat myös, että kitosaani näyttää parantavan kirkastuksen tehokkuutta flokkuloimalla submikronisia hiukkasia, jotka tyypillisesti laskeutuvat sentrifugeissa. Esikäsittely- ja flokkulointimenetelmät tulevat todennäköisesti jatkossakin olemaan osa tulevia rokotteiden suodatuksen selvennyksiä. Tunkeutuvat aineet, mukaan lukien sokerit, glykolit ja aminohapot, flokkuloivat ensisijaisesti viruksia. Viruksen flokkulaatiota osmoottisella liuoksella ja sen jälkeen 0,2 µ mikrosuodatusta voidaan käyttää kattavana viruspuhdistusprosessina. Penetrantit voivat stimuloida viruksen aggregaatiota vähentämällä hiukkasten ympärillä olevaa hydraatiokerrosta flokkuloimaan hydrofobisia kapseloimattomia viruspartikkeleita ja kapseloituja viruspartikkeleita. Vaikka penetranttien on osoitettu flokkuloivan viruksia, menetelmällä on potentiaalia toimia alustana tulevalle rokotteen puhdistukselle, eikä sen käyttökelpoisuutta pilotti- tai laajamittaisessa rokotteen puhdistuksessa ole todistettu. Flokkulaatioesikäsittelymenetelmä, joka todennäköisesti tulee jatkossakin olemaan osa tulevaa rokotesuodattimen selkeyttämistä, suoritetaan 2 litran fermentorissa. Jotta näitä menetelmiä voitaisiin mahdollisesti käyttää laajamittaisessa tuotannossa, ne on validoitava pilotti- ja tuotantomittakaavassa.
2.2.1 Järjestelmävaikutuksen ilmaiseminen
Selkeytysmenetelmä riippuu pääasiassa ylävirran prosessin tyypistä ja ekspressiojärjestelmästä, joka määrittää poistettavien kontaminanttien tyypin ja tason. Virusrokotteita tuotetaan yleensä kanan alkioissa jatkuvilla nisäkkäiden tai lintujen solulinjoilla tai bakulovirus/hyönteissoluilla, jotka ovat monimutkaisempi ilmentämisjärjestelmä. Joitakin VLP-tyyppejä voivat myös tuottaa muut heterologiset ilmentämisjärjestelmät (bakteerit, hiiva, kasvisolut).
2.2.1.1 Kanan alkiossa tuotettu virus
Rokotteita on valmistettu munissa vuosikymmeniä. Tämä työ juontaa juurensa vuoteen 1931, jolloin Woodruff ja good Pasture käyttivät menestyksekkäästi hedelmällisten munien korio-allantoiskalvoa viruksen kasvun substraattina. Nykyään monia ihmisille ja eläimille tarkoitettuja rokotteita valmistetaan edelleen tällä ikivanhalla menetelmällä. Tunnetuin lienee kausi-influenssarokote. Periaatteena on inokuloida kananmunat kiinnostavilla viruksilla ja sitten replikoitua korio-allantoiskalvossa. Lisääntymisen jälkeen viruspartikkeleita sisältävä allantoisneste kerätään ja puhdistetaan.
Allantoisneste on haastava kirkastava rehu. Sen korkea mineraali- ja proteiinipitoisuus (mukaan lukien ovalbumiini) antaa sille korkean viskositeetin. Allantoisneste sisältää myös kanan alkioiden välttämättömiä kudosyhdisteitä, kuten höyheniä, nokkia, verisuonia tai verisoluja. Korkean kiintoainepitoisuuden vuoksi alhainen sentrifugointi on ensisijainen vaihtoehto ensiselkeyttämiseen, mikä johtaa tyypillisesti noin 70 %:n talteenottoasteeseen. Ensisijainen selkeytys suodatustekniikoita käyttämällä on kuitenkin myös mahdollista. NFF:lle polypropeeni- ja selluloosapohjaisilla syväsuodattimilla on hyvät allantoisnesteen keruuominaisuudet. Polypropeenista tai selluloosapohjaisista syväsuodattimista valmistettujen pintasuodattimien kapasiteetti voi olla 150-210 L/m² ja ne voivat vähentää syöttövirran sameutta jopa 3 kertaa. Avoin syöttökanava TFF-laite soveltuu myös allantoisnesteen selkeytykseen, sillä laite soveltuu paremmin minimaaliseen painehäviöön syöttökanavan läpi, mikä vähentää kanavan tukkeutumista.
Toissijainen selkeytysvaihe voidaan tehdä helposti NFF:llä. Polypropeeni-, selluloosa- ja lasikuitumateriaalien yhdistelmällä on yleensä hyvä hyötysuhde, ja vaihtoehtona toissijaiselle selkeytysvaiheelle on käyttää TFF:ää ja {{0}},65 μm tai 0,45 μm mikrosuodatuskalvolaitetta ja käyttää osmoottista vuota. ohjata. Tässä vaiheessa voidaan käyttää avoimen kanavan TFF-laitetta, jossa on hydrofiilinen PVDF tai hydrofiilinen PES-kalvo.
On tärkeää huomata, että viruspartikkelit voivat liittyä liukenemattomaan roskamateriaaliin, mikä voi vähentää merkittävästi virustuotantoa kirkastuksen aikana. Suolaliuoksen käyttö voi vähentää tätä yhteyttä influenssavirusten ja kiinteiden fragmenttien välillä, mikä johtaa noin kaksinkertaiseen tuotannon kasvuun vaikuttamatta viruspartikkelien eheyteen.
2.2.1.2 Peräkkäisissä nisäkäs- ja lintusolulinjoissa tuotetut virukset
Viime aikoina jotkin virusrokotteet ovat siirtyneet pois munapohjaisista prosesseista soluviljelmiin perustuviin prosesseihin (erityisesti influenssarokotteisiin). Pääsyy tähän muutokseen on estää alkionmuniin liittyviä rokotetuotannon ongelmia (eli munatarjonnan puutetta, joka voi ilmetä minkä tahansa siipikarjan taudin puhkeamisen yhteydessä). Tämän seurauksena usean tyyppisiä rokotteita ja virusvektoreita kehitetään tällä hetkellä käyttämällä jatkuvia solulinjoja nisäkkäistä tai linnuista, tavanomaisia solulinjoja (kuten Vero-, MDCK- tai HEK293-solulinjoja) tai patentoituja solulinjoja.
Ilmentämisjärjestelmästä riippuen virus voi jäädä solun sisälle vaatien solun lyysivaiheen tai se voi jäädä solun ulkopuolelle (lyysi tai silmujen muodostuminen). Soluviljelmästä saatu kiinteä kuorma ja liukoinen pitoisuus ovat paljon puhtaampia kuin allantoinen nestefaasi. Tämän seurauksena NFF-teknologia on helpompi toteuttaa ja kapasiteetti on huomattavasti suurempi. Suodatuskapasiteetti riippuu kuitenkin suuresti soluviljelyolosuhteista, kuten solutiheydestä tai solujen elinkelpoisuudesta sadonkorjuun yhteydessä. Nämä parametrit vaikuttavat solujätteen ja makroaggregaattien määrään, joka voi tukkia syväsuodattimia ja kalvoja, mikä johtaa kapasiteetin vähenemiseen.
Thomassen ym. tarjoavat hyvän esimerkin NFF-selvennyksestä. Käytetään inaktivoidun polioviruksen (IPV) tuotantoprosessissa. Mikrokantajilla viljeltyjä Vero-soluja käytettiin viruksen lisääntymiseen solutiheydellä {{0}},78 x 106 solua/ml TOI. 75 μm ruostumattomasta teräksestä valmistettua seulaa käytetään esiselkeytykseen mikrokantajien poistamiseksi sadosta. Kaksikerroksinen lajittelu kirkastetaan käyttämällä tiheyssyväsuodatinta (0.{7}},0 μm), jota seuraa steriloitu laatusuodatin.
Valittua skaalautuvaa kertakäyttöyksikköä käytettiin menestyksekkäästi Sabin IPV:n kliinisen kokeen materiaalin valmistukseen 350 litran mittakaavassa. Viruksen serotyypistä riippuen viruksen palautumisaste on 86 - 96 prosenttia.
2.2.1.3 Bakulovirus/viruksen kaltaiset hiukkaset, joita tuotetaan hyönteissolujärjestelmässä
Bakulovirus/hyönteissolujärjestelmien harkitseminen laajamittaisessa rokotetuotannossa on suhteellisen uutta, mutta se herättää kasvavaa kiinnostusta virusvektoreiden ja VLP:iden alalla. Tämän järjestelmän tärkein etu on, että se sisältää lyhytaikaista (ei tarvitse muodostaa solulinjoja) ja turvallista (ei täydellistä virus-DNA:ta) tuotantoa. On myös joitain haittoja, kuten tarve bakuloviruksen poistoon ja tuotteen stabiilisuus.
Cervarix, GlaxoSmithKlinen tuottama VLP-rokote ihmisen papilloomavirusinfektiota vastaan, on ensimmäinen ihmisrokote, joka on valmistettu kaupallisesti hyönteissoluissa. Useita rokotteita, jotka perustuvat bakuloviruksella infektoituneissa hyönteissoluissa tuotettuihin VLP- ja rAAV-vektoreihin, on parhaillaan kehitteillä. Hyönteissolulinjat, jotka on johdettu syksyn armeijamatosta Spodoptera frugiperda (Sf9 ja Sf21) ja kaalin käämimatosta Trichoplusia ni (BTI-TN5B1-4 solut), ovat yleisimmin käytettyjä, koska ne pystyvät kasvamaan suspensiossa, mikä yksinkertaistaa ylävirran monistamista. käsitellä. Kun nämä solut on kasvatettu haluttuun elävien solujen tiheyteen, ne infektoidaan rekombinantilla bakuloviruksella eksponentiaalisessa solukasvuvaiheessa proteiinin ilmentämistä varten. Bakulovirusten suuri genomi mahdollistaa viiden tai useamman erilaisen proteiinin ilmentämisen, mikä vastaa VLP:n ja virusvektorien monimutkaisuutta.
Bernard et ai. kuvaili hyönteissoluviljelyn alavirran prosessia. Prosessi on erittäin vaihteleva, mikä kuvastaa tällä tekniikalla tuotettujen proteiinien monimuotoisuutta. Puhdistussekvenssin ensimmäiseen vaiheeseen vaikuttavat voimakkaasti bioreaktorin tilavuusominaisuudet (eli solutiheys ja elinkelpoisuus) tai tuotteen vapautumisen luonne (erittyy silmujen tai solujen hajoamisen kautta). Hyönteissolujen bakulovirusinfektio voi aiheuttaa solujen hajoamisen 3-5 päivässä. Solujen tuhoutuminen voi johtaa proteolyyttisen aktiivisuuden lisääntymiseen ja muihin ympäristötekijöihin, jotka voivat johtaa rekombinanttiproteiinien hajoamiseen.
On yritetty kehittää bakuloviruksia, joiden kyky aloittaa solujen hajoaminen on pienempi. Bakulovirus hajottaa alle 10 prosenttia tartunnan saaneista hyönteisistä.
Solujen lyysi voidaan suorittaa erilaisilla menetelmillä, kuten jäädytys-sulatus, pesuaineet, homogenisaattorit tai ultraäänikäsittely. Hyönteissoluilla ei ole soluseinää, joten ne liukenevat nopeasti. Vaikka ultraäänikäsittelyä on raportoitu monissa penkkiprosesseissa, sitä käytetään harvoin kokeellisessa tai kaupallisessa mittakaavassa. Yleisin tapa on käyttää homogenisaattoria solujen tuhoamiseen alhaisen detergentin (0.1 % Triton X-100 tai NP-40) läsnä ollessa. Pesuaineiden käyttöä ja mikrofluidisaatiota tai osmoottista iskuhomogenointia on käytetty menestyksekkäästi monissa laajamittaisissa valmistusprosesseissa. Tyypillisesti hyönteissolut suspendoidaan lyysipuskureihin (50 mM TRIS pH 7,7, 300 mM NaCl, 5 % glyseroli, 0,2 mM PMSF ja proteaasi-inhibiittorit), jonka aikana Triton-X100 lisätään 0,1 %:n lopulliseen pitoisuuteen, jota seuraa lievä ultraääni tai mikrofluidisointi. Sitten seos sentrifugoidaan liukenemattomien hiukkasten poistamiseksi.
Tässä vaiheessa lysaatti voi näyttää hyvin samealta ja sitä on vaikea suodattaa käyttämällä 0,45 μm:n suodatinta. Joskus voidaan havaita jopa 30 %:n häviöitä pyrolyysin kirkastusvaiheen aikana. Bentsoentsyymien lisääminen katkaisuvaiheessa auttaa ratkaisemaan suodatusongelman. Solujen puhdistaminen fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella sadonkorjuun jälkeen ja nopea "jäädytys-sulatus" korkeassa suolapitoisuudessa (500 mM NaCl), joka sisältää krakkauspuskurin, auttaa poistamaan aggregaatteja.
Hyönteissolujen tuottamien VLP:iden ja virusvektoreiden selkeytyminen tapahtuu solulyysin jälkeen (kemiallisella tai mekaanisella käsittelyllä), joka vapauttaa viruspartikkelien lisäksi suuria määriä solun nukleiinihappoa. Hyönteissolut pystyvät kasvamaan suurella solutiheydellä alkaen 1-9.10 6 solusta/ml. Siksi selkeytysvaiheessa tulisi käsitellä suurta solutiheyttä, korkeaa nukleiinihappopitoisuutta ja, jos mahdollista, bakuloviruspartikkelien poistamista. Asioiden monimutkaisuuden vuoksi VLP:t tai virusvektorit ja bakulovirukset voivat olla samankokoisia (baculovirukset ovat 60-80 nanometriä leveitä ja 300-400 nanometriä pitkiä). Suuresta solutiheydestä johtuen sentrifugointi on ollut ensisijainen tekniikka primääriselkeytyksessä vuosikymmeniä. Kalvoprosessit näyttävät kuitenkin olevan erittäin houkutteleva vaihtoehto, koska skaalautuvuus on helppo määritellä.
Syväsuodattimia on käytetty tehokkaasti kolmikerroksisten rotaviruksen kaltaisten hiukkasten jälkikäsittelyprosessissa. Laboratoriotasolla CsCl-tiheysgradienttiultrasentrifugointimenetelmää käytetään usein näiden monimutkaisten hiukkasten puhdistamiseen. Tutkijat arvioivat syväsuodattimen selkeytysvaiheen lisäksi myös koko loppuprosessin (Triton X-100 -pilkkominen ja syväsuodatus, jota seurasi ultrasuodatus ja hiukkaskoon poissulkeminen). Tulokset osoittavat, että CsCl-tiheysgradientin saanto voi olla 37 %.
Ultrakeskipakomenetelmä on noin 10%. Toisena esimerkkinä 0,45 μm onttoja kuituja ja 500 kDa:n hienojakoisia kuituja käytettiin hyönteissoluissa tuotettujen HIV:n kaltaisten hiukkasten talteenottamiseksi ja keskittämiseksi. Tässä tutkimuksessa onttojen kuitujen leikkausvoima optimoitiin solun eheyden perusteella. Tulokset Pienen leikkausvoiman menetelmä luotiin korvaamaan pöytäsokerigradienttiultrasentrifugointi.
Prosessilla on potentiaalia soveltaa massatuotantoon. Syväsuodattimia on myös käytetty menestyksekkäästi rekombinanttien adeno-assosioituneiden virusten tuotannossa. Solujen lyysi suoritettiin kaksimäntäisellä mekaanisella soluhäiriölaitteella, mitä seurasi nukleaasikäsittely. Selkeytysvaiheessa käytettiin 1,2 μm lasikuitua syväsuodatinelementtiä, jota seurasi kaksi kerrosta 0,8 μm hydrofiilistä PES:ää ja 0,2 μm hydrofiilistä PES:ää. Suhteellisen kokoisia suodattimia käytetään prosessierissä pienemmistä 200 litran kokoisiin. Syväsuodattimia on käytetty menestyksekkäästi, ja TFF-luokitukset litteillä kalvoilla tai ontoilla kuiduilla 0,2 µm tai 0,45 µm on myös raportoitu olevan erittäin tehokkaita.
Tecnologican (IBET) tutkimuksessa Oeiras Institute of Experimental Biologyssa Portugalissa käytettiin NFF:ää bakulovirusten ilmentämän C-hepatiitti VLP:n selvittämiseen ilman sentrifugointia. Nimellisarvoisia polypropeenisuodattimia (10,5,0.6 ja 0.3 μm) käytetään VLP-korjuun selventämiseen. VLP-keräyskeskuksissa käytetään samoja suodattimia, joiden huokosluokitukset ovat 0,6 μm ja 0,3 μm. Kaikki tutkitut suodokset testattiin HCV-VLP:n talteenottonopeuden suhteen ja suositeltuja suodatusmenetelmiä verrattiin. Tulokset on esitetty taulukossa 4.
Tulokset osoittivat, että 5 µm-0.3 µm suodattimella oli suurin tuotteen saanto (100 %) suoraan kerätylle hepatiitti C VLP -syötölle. Polypropeenisuodattimella, jonka koko on 0,6 μm, oli suurin tuotteen saanto (82 %) keskussyötössä, ja isäntäsolun DNA-puhdistuma oli noin 70 %.
2.2.1.4 Bakteeri- tai hiivajärjestelmissä tuotetut viruksen kaltaiset hiukkaset
Bakteeri- tai hiivajärjestelmissä ilmennettyjen VLP-rokotteiden selkeytysmenetelmän tyyppi riippuu VLP:n vapautumisesta solunulkoisiin välittäjiin. Jos VLP:itä ei voida erittää tehokkaasti, voidaan tarvita solulyysi- tai muita uuttovaiheita ennen varsinaista selkeytysvaihetta. Vaikka tämä on kultainen standardi proteiinien selkeytysteollisuudessa, sentrifugointi (jatkuva tai erä), joka ilmaistaan bakteeri- tai hiivapohjaisissa järjestelmissä, viime aikoina kalvoprosesseista on tullut erittäin houkutteleva vaihtoehto, koska ne ovat helposti skaalautuvia ja yhteensopivia kertakäyttöisten kanssa. hoidot.
Richter ja Topell selittävät sentrifugoinnin, TFF:n tai molempien yhdistelmän käyttöä valmistettaessa kirkastetussa E. colissa tuotettuja VLP:itä. Heidän työssään 0,45 m TFF-kalvoja käytettiin homogenisoitujen E. coli -homogenaattien laimentamiseen ja kirkastukseen 5 asteen lämpötilassa. He huomauttavat myös, että kalvopohjainen TFF soveltuu korkean viskositeetin sadon käsittelyyn, mieluiten käyttämällä TFF-yksiköitä, joissa on avoin kanavakonfiguraatio.
Keskipakokirkastusta on myös arvioitu vaihtoehtona TFF:lle. Tässä tapauksessa saatua homogenaattia ei laimennettu ja sentrifugoitiin 4 asteessa 105 minuuttia, 10000g. Siirtämättä pehmeää pinnoitetta, supernatantti kaadettiin pois hiukkasista ja sentrifugoitiin uudelleen 4 asteessa ja 10 000 g:ssä 60 minuuttia. Supernatantti poistettiin sitten esillä olevista partikkeleista, laimennettiin EB-puskurilla (43,89 mM Tris HCl, 6,11 mM Tris Base, 5,0 mM EDTA, 10 % (v/v) Triton X-100) 1:2 ja suodatettiin. 0,22 m steriilillä suodatinlaitteella. Jatkokäsittely. Mittakaavan lisäämisprosessi tämän VLP-rokotteen tuottamiseksi E. colissa 800 litran mittakaavassa selvitettiin myös sentrifugoinnin ja TFF:n yhdistelmällä.
Rekombinantti hepatiitti E -rokote HEV 239 on lisensoitu Kiinassa 16-vuotiaiden ja sitä vanhempien aikuisten immunisointiin. Rokoteantigeenit (VLP) ilmentyvät E. colissa, ja antigeenin tuotantoprosessin laajenemisen on osoitettu olevan 50L. Tuote uutettiin krakkaamalla E. coli ja inkluusiokappaleet erotettiin solufragmenteista pesemällä voimakkaasti puskurilla, joka sisälsi 2 % Triton X-100, ja liuotettiin sitten 4 M ureahomogenisaattorilla. TFF selkeyttää ihmisen papilloomaviruksen VLP:tä, joka on tuotettu Saccharomyces cerevisiaessa (15 l). Nukleaasilla käsitelty solulysaatti kirkastettiin ristivirtausmikrosuodatuksella transsuodatustilassa käyttäen 0,65 μm onttokuitusuodatinta. Samaa menetelmää käytetään rokotteiden valmistuksessa. Vaikka vain kourallinen VLP-pohjaisia rokotteita on saavuttanut kaupallisen mittakaavan, useita VLP-pohjaisia rokotteita on kehitteillä, joista suurin osa kirkastetaan sentrifugointi- tai kalvoteknologialla.
Avaruuden vaikutuksen rajoittama, jaamme sisällön toisen puoliskon seuraavassa luvussa. Seuraavassa artikkelissa kerromme joitain tapauksia rokotteen selventämisestä ja asiaankuuluvien kalvokomponenttien käytöstä.
Guidling Technologylla on lokalisointipiirin ensimmäisenä yrityksenä kertynyt riittävästi relevanttia kokemusta rokotteen selkeytyksestä. Guidling Technology on biofarmaseuttiseen ja soluviljelyyn, puhdistukseen ja erotukseen keskittyvä kehitys- ja tuotantoyhtiö. Tuotteita käytetään laajalti biolääketieteessä, diagnoosissa, teollisessa nesteiden suodatuksessa, havaitsemisessa, selkeytyksessä, puhdistus- ja väkevöintiprosessissa; Guidling on menestyksekkäästi kehittänyt ultrasuodatussentrifugiputken, ultrasuodatus/mikrosuodatuskalvokasetin, viruksenpoistosuodattimen, tangentiaalivirtauksen suodatinlaitteen, syvän kalvopinon jne., jotka täyttävät täysin biofarmaseuttisen ja soluviljelyn sovellusskenaariot.
Kalvojamme ja kalvosuodattimiamme käytetään laajasti esisuodatuksen, mikrosuodatuksen, ultrasuodatuksen ja nanosuodatuksen tiivistämiseen, uuttamiseen ja erottamiseen. Laaja valikoimamme pienistä kertakäyttöisistä laboratoriosuodattimista tuotantotyyppisiin suodatusjärjestelmiin, steriiliystestaukseen, fermentointiin, soluviljelyyn ja moneen muuhun pystyy vastaamaan testauksen ja tuotannon tarpeisiin.