Tutkimus rekombinantin Escherichia colin korkean tiheyden fermentaatiolysaatin selkeytysprosessista

 

Materiaalinesteen häiriön vähentämiseksi kromatografiaan ja kohdeproteiinin talteenoton parantamiseksi tutkittiin kahden rekombinantti Escherichia coli -kannan korkeatiheyksisen fermentaatiolysaatin selkeytysprosessia. Valittiin kannat BL21-HP1036 ja BL21-palA, jotka ilmentävät Streptococcus suis- ja Haemophilus parasuis -bakteerien avaingeenejä. Tangentiaalivirtausprosessia, nopeaa sentrifugointiprosessia ja kalvokasetin selkeytysprosessia käytettiin proteiinisaannon arvioimiseen sameus- ja elektroforeesitunnistuksen avulla.

 

Tulokset osoittivat, että BL21-HP1036, BL21-palA korkeatiheyksinen fermentaatiolysaatti, joka ekspressoi Streptococcus suis- ja Haemophilus parasuis -bakteerien avaingeenejä, selkeytettiin kalvokasettisuodatuksella ja sentrifugoinnilla, ja proteiinisaanto oli yli 80 %. mikä voisi tehokkaasti vähentää kromatografisia häiriöitä ja parantaa palautumisnopeutta.

 

Johdanto

Tällä hetkellä Streptococcus suis (SS) ja Haemophilus parasuis (HPS) ovat sikatilojen yleisimmät bakteeritautien patogeenit, jotka aiheuttavat suuria tappioita sikateollisuudelle. SS voidaan jakaa yhteensä 35 serotyyppiin 1-34 ja 1/2, ja HPS voidaan jakaa 1-15 serotyyppeihin, ja nämä kaksi ovat usein sekoittuneet, mikä aiheuttaa pääasiassa sian polyserosiittia, niveltulehdusta, aivokalvontulehdusta ja endokardiittia. , bakteeriperäinen septikemia ja keuhkoputkentulehdus.

 

Streptococcus suis- ja Haemophilus parasuis -serotyyppien suuresta määrästä johtuen eri serotyyppien välinen ristisuojaus on heikko ja antibioottiresistenssi kasvaa merkittävästi antibiooteilla hoidettuna, mikä vaikuttaa terapeuttiseen vaikutukseen.

 

Rokotteista on tullut yksi tehokkaista keinoista ehkäistä SS:tä ja HPS:ää. On olemassa inaktivoituja rokotteita, heikennettyjä rokotteita, eläviä rokotteita, alayksikkörokotteita ja geenimanipuloituja rokotteita, mutta inaktivoituja rokotteita ja heikennettyjä rokotteita on pääosin markkinoilla ja niiden immuunisuoja on hyvä, mutta ristisuojaus ei ole ilmeinen. Alayksikkörokote on uudenlainen streptococcus suis -rokote, joka on uudenlainen rokote, jolla on vahva ristisuoja ja edullinen hinta. Streptococcus suis- ja Haemophilus parasuis -bakteerien alayksikkörokotteiden tutkimus ja kehitys tarjoaa täydellisen ratkaisun Kiinan sikateollisuutta vaivaavien Streptococcus suis- ja Haemophilus parasuis -bakteerien ehkäisyyn ja torjuntaan.

 

Streptococcus suis- ja Haemophilus parasuis -alayksikkörokotteet altistetaan korkeatiheyksiselle fermentaatiolle rekombinantti Escherichia coli -bakteerilla. Lysaatin selkeytyksellä on suuri vaikutus kohdeproteiinien saantoon, mutta asiaankuuluvia raportteja on vähän. Käymis- ja puhdistusprosessin selkeytysvaiheen toteuttaminen on tärkeä työ. Tässä artikkelissa tavoitteena on rekombinantti E. coli BL21-HP1036, BL21-palA korkeatiheyksinen fermentaatio, jonka tarkoituksena on tutkia, kuinka tehokkaasti voidaan vähentää kirkastusliuoksen sameutta, parantaa proteiinisaantoa, Streptococcus suis -alayksikkörokotteen käymisprosessi, jolla saavutetaan teollinen murskaus- ja selkeytystekniikka teoreettisen perustan ja teknisen tuen tarjoamiseksi.

 

1. Materiaalit ja menetelmät

1.1 Materiaalit

 

1.1.1 Kannat

Streptococcus suis- ja Haemophilus parasuis -kannat BL21-HP1036, BL21-pa-lA

 

1.1.2 Pääväliaineet ja reagenssit

Hiivauute ja pyöriäinen; natriumkloridi; kanamysiini, IPTG; Formaldehydi; SDS-PAGE geelisarja.

 

1.1.3 Päätestilaitteet

Korkean tiheyden fermentori; Nopea sentrifugi; Elektroforeesilaitteet; Ultravioletti geeli kuvantamisjärjestelmä; Ultraäänimurskain; Pieni nopea sentrifugi; Ultravioletti-spektrofotometri; Vakiolämpötila ravistelu taulukko; Affiniteettikromatografialaitteet.

 

1.2 Menetelmät

 

1.2.1 Korkeatiheyksinen käymisviljelmä

Hyväksytyt rekombinanttikoliformiset kannat BL21-HP1036 ja BL21-pa-lA siirrostettiin synteettiselle alustalle 2 % (tilavuus/tilavuus) ja viljeltiin 37 asteessa 35-40 tuntia.

 

1.2.2 Rekombinanttiproteiinin aiheuttama ekspressio

Kun fermentaatioliuos OD{{0}}±0.1, induktio alkoi, induktiolämpötila oli 35 astetta ±0,5 astetta ja viljely lopetettiin 10 tunnin induktion jälkeen.

 

1.2.3 Korkeapaineinen homogeeninen murskaus ja sentrifugointi

Bakteerineste, joka läpäisi inaktivointitestin, murskattiin korkeapainehomogenisaattorilla vastaavasti solun krakkausta varten paineella 100-150 MPa. Murskauksen jälkeen murskattu neste pidettiin alhaisessa lämpötilassa.

Supernatantti saatiin sentrifugoimalla suurella nopeudella, keskipakonopeus: 15000 rpm, lämpötilan säätö: 10 astetta ~ 15 astetta, ruiskutusnopeus: 0,5 - 1 l/min, vastaavasti, supernatantti kerättiin ja supernatantti täytettiin säiliöillä, jotka poistivat endotoksiinin.

 

1.2.4 Mikrosuodatuskalvokasetin selkeytys

Kalvo pestiin 1 0L puhdistettua vettä yhteen suuntaan ja suoritettiin tangentiaalinen virtaussuodatus. 300 ml rikkoutunutta bakteerisuspensiota sentrifugoinnin jälkeen otettiin putkisentrifugista ja kirkastettiin 0,45 um:n mikrosuodatuskalvokasetilla. Sameus mitattiin ottamalla vastaavasti näytteitä, ja sameutta sentrifugoinnin jälkeen, mikrosuodatuskalvokasetissa olevan kirkastetun nesteen sameutta ja mikrosuodatuskalvokasetin väkevöidyn nesteen sameutta verrattiin. Näytteen proteiinipitoisuus havaittiin kromatografialla ja elektroforeesilla proteiinisaannon arvioimiseksi.

 

Vaihe 2: Tulokset

2.1 BL21-HP1036- ja BL21-palA-proteiinin selvitystiedot ja testitulokset

Kuvion 2 tulokset Kuva 1 osoittaa, että BL21-HP1036:n ja BL21-palA-rekombinantin Escherichia coli -murskausnesteen sameus laski 4 500 NTU:sta ja 4 000 NTU:sta 1970 NTU:han ja 520 NTU:han, vastaavasti, putken sentrifugoinnin jälkeen. BL21-HP1036- ja BL21-palA-rekombinantti Escherichia coli -bakteerin sameus väheni 25 NTU:han ja 1,28 NTU:han mikrosuodatuskalvokasettimenetelmällä. Voidaan nähdä, että mikrosuodatuskalvokasetin tangentiaalisen virtaussuodatuksen ja optimoidun avoimen virtauskanavan käytöllä on hyvä vaikutus endotoksiinin, viskositeetin ja kromatografisen nesteen sameuden vähentämiseen kuin perinteinen sentrifugisuodatus, ja se voi vähentää merkittävästi rikkoutunutta rekombinantti E. coli -heteroproteiinia. ja nukleiinihappo.

 

2.2 BL21-HP1036- ja BL21-palA-näytteiden proteiinin talteenotto

Taulukko 1 osoittaa, että rekombinantti Escherichia coli BL21-HP1036-proteiinia on sekä mikrosuodatuksella selkeytetyssä liuoksessa että tiivistetyssä supernatantissa, joka on peitetty mikrosuodatuskalvolla, ja proteiinin kokonaissaanto sen jälkeen, kun proteiini on otettu talteen mikrosuodatuksella kirkastetusta liuoksesta ja väkevöidystä supernatantista. on noin 88,5 %. BL21-palA-proteiinia oli myös mikrosuodatusnesteen kirkastetussa liuoksessa ja väkevöidyn liuoksen supernatantti peitetty mikrosuodatuskalvokasetilla. BL21-PALa-proteiinin kokonaissaanto oli 81,5 %.

 

3. Johtopäätös

Tässä artikkelissa Streptococcus suiksen ja Haemophilus parasuisin avaingeenejä BL{{0}}HP1036 ja BL21-palA ilmentävät kannat kävivät läpi korkean tiheyden fermentaation ja läpäisivät 0,45. Materiaalinesteen sameus oli um-mikrosuodatuskalvokasettiprosessi vähentää merkittävästi, mikä osoittaa, että tangentiaalivirtaussuodatustekniikka mikrosuodatuskalvokasetilla oli parempi kuin nopean sentrifugin tekniikka, ja se saattoi vähentää merkittävästi rikkoutuneen rekombinantin Escherichia colin epäpuhtausproteiinia ja nukleiinihappoa.

 

Sen jälkeen kun kirkas neste oli kerätty yhteen mikrosuodatuskalvokasettiin, siinä oli 62,9 % Koska 37,1 % BL21-HP1036:n kohdeproteiinista oli mikrosuodatuskonsentraattia tai sitä oli mikrosuodatuskalvokasetissa ja muita häviöitä , otettiin käyttöön kaksivaiheinen menetelmä selventämiseksi. Ensimmäisessä vaiheessa käytettiin 0,45 um:n mikrosuodatuskalvokasettia eritteen selkeyttämiseen ja keräämiseen; toisessa vaiheessa jäljelle jäänyt konsentroitu neste kerättiin putkisentrifugoinnin jälkeen ja kaksivaiheinen kirkastettu neste yhdistettiin kromatografinäytteeksi. BL21-palA-fermentointinesteen sameusarvo ei noussut merkittävästi, proteiinisaanto saattoi saavuttaa yli 85,5 % ja BL21-Pala-fermentointinesteen proteiinisaanto voi nousta 81,5 %:iin kaksivaiheisen käsittelyn jälkeen.

 

Mitä tulee mikrosuodatuskalvokasetin valintaan, Guidling Technology voi tarjota sinulle korkealaatuisia ratkaisuja. Mikrosuodatuskalvokasetti- ja ultrasuodatuskalvokasettisarjamme tuotteissamme käytetään kantajana polyeetterisulfonia, joka on erityisesti suunniteltu bioteknologiaan. Polyeetterisulfonikalvollamme on korkea suorituskyky, alhainen proteiiniadsorptio, korkea mekaaninen lujuus, iskunkestävyys ja niin edelleen. Tarjoamme sinulle erityisiä kalvopuristimia tulo- ja poistoaukon paineen mittaamiseen reaaliajassa ja voimme tarjota teknisiä käyntejä tarpeidesi mukaan räätälöidäksesi erityistä ultrasuodatus-/mikrosuodatusjärjestelmääsi. Tällaista pientä tangentiaalivirtausjärjestelmää voidaan käyttää pieneen, pilotti- ja pienimuotoiseen tuotantoon, ja se voi olla täysin lineaarinen vahvistus, jotta se täyttää täysin testivaatimukset ja tuotantovaatimukset.

Tietoja Guidlingistä

Guidling Technology on valtakunnallinen korkean teknologian yritys, joka keskittyy biofarmaseuttisiin valmisteisiin, soluviljelyyn, biolääketieteen puhdistukseen ja konsentroimiseen, diagnoosiin ja teollisuusnesteisiin. Olemme onnistuneesti kehittäneet keskipakosuodatinlaitteita, ultrasuodatus- ja mikrosuodatuskasetteja, virussuodattimia, TFF-järjestelmiä, syvyyssuodattimia, onttoja kuituja jne., jotka täyttävät täysin biofarmaseuttisten tuotteiden, soluviljelyn ja niin edelleen sovellusskenaariot. Kalvojamme ja kalvosuodattimiamme käytetään laajasti esisuodatuksen, mikrosuodatuksen, ultrasuodatuksen ja nanosuodatuksen tiivistämiseen, uuttamiseen ja erottamiseen. Monet tuotelinjamme pienestä kertakäyttöisestä laboratoriosuodatuksesta tuotannon suodatusjärjestelmiin, steriiliystestaukseen, fermentointiin, soluviljelyyn ja muuhun vastaavat testauksen ja tuotannon tarpeita. Guidling Technology odottaa innolla yhteistyötä kanssasi!