Kalvotekniikka ja rokotteiden selkeyttäminen (Ⅱ)

Edellisessä artikkelissa meillä oli alustava johdatus rokotteisiin ja rokotteiden selventämisstrategioihin, ja jatkamme niiden tutkimista tämän artikkelin loppuosassa. Jatkamme edellä mainitun mukaisesti rokoteselvennyksiä ja niihin liittyviä kalvokudossovelluksia.

 

2.2.2 Viruksen fysikaalisten ja kemiallisten ominaisuuksien vaikutus

Kun tuotantojärjestelmä ja menetelmät asiaankuuluvien kontaminanttien poistamiseksi selkeytysvaiheessa on harkittu, on tärkeää ottaa huomioon viruksen ominaisuudet ja keskittyä virussaannon maksimointiin.

 

2.2.2.1 Helppo virusadsorptio
Positiivisesti varattuja materiaaleja ja suodatusapuaineita (kuten piimaa) on kehitetty parantamaan syväsuodatusvaikutuksia. Vaikka positiivinen varaus lisää nukleiinihappojen ja HCP:n talteenottoa, piimaan tiedetään sitovan solujäämiä ja kolloideja. Nämä materiaalit voivat kuitenkin myös pidättää viruksen adsorptiomekanismin kautta. Koska virus on yleensä negatiivisesti varautunut liuoksessa, sähköstaattista vuorovaikutusta positiivisesti varautuneen suodattimen kanssa saattaa esiintyä.
Virukset voivat myös sitoutua hydrofobisilla tai epäspesifisillä vuorovaikutuksilla tiettyjen suodatinmateriaalien (kuten piimaan tai lasikuitujen) kanssa. Vaipalliset virukset ovat lipidivaippansa vuoksi herkempiä tälle adsorptiolle. Jos virus adsorboituu suodattimeen sähköstaattisten vuorovaikutusten kautta ja viruspartikkelit irtoavat suolakilpailun vuoksi, suodattimen huuhtelu erittäin johtavalla puskurilla voi saada viruksen osittain talteen. Tämä voi kuitenkin myös eluoida kontaminantteja, kuten HCP:tä tai nukleiinihappoja. Siksi vaihtoehtoisen suodatinmateriaalin, kuten inerttimmän polypropeenin, käyttö on edullista.
Adenovirus is easily adsorbed, but different results have been confirmed. Using positively charged diatomite and deep filters. Borosilicate glass fiber filter material is also very well recovered. On the other hand, a patent proposed by Weggeman involving clarification of 20 – 40% adenovirus losses at PER, et al. Cell cultures were prepared with similarly positively charged deep filters containing diatomite. In this case, the nominal polypropylene filter showed a very high viral recovery rate (> 90%).
On hyvin tunnettua, että influenssavirukset ovat alttiita adsorptiohäviöön kirkastuksen aikana. Siksi latautumattoman suodattimen, polypropeenipohjaisen suodattimen, käyttö soveltuu influenssakeräyksen selkeyttämiseen. Thompson ym. raportoivat nimellisen 1,2 μm:n polypropeenisuodattimen ja sen jälkeen 0,45 μm PVDF-kalvon käytön MDCK-solujen tuottaman solupohjaisen influenssaviruksen selkeyttämiseksi. Yhteensä yhdeksän puhdistustestiä suoritettiin 20L:n asteikolla, kuormitus 111 l/m2 1,2 μm polypropeenisuodattimella ja 105 l/m2 0,45 μm PVDF-suodattimella. Tulokset osoittivat, että suurin osa käynnissä olevista viruksista toipui hyvin (78-154%). He ilmoittivat myös hcDNA:n poistamisesta jopa 58 %, mutta ei merkittävää HCP-poistoa.

 

2.2.2.2 Herkkien virusten leikkaaminen

Joillakin viruksilla (kapseloiduilla tai kapseloimattomilla) on alhainen mekaaninen kestävyys, ja ne voivat tuhoutua leikkausaltistuksen seurauksena sentrifugoinnin ja kalvosuodatusvaiheiden aikana. Leikkausvoimat, jotka syntyvät puhdistusvaiheissa, joihin liittyy suodatus tai kromatografia, voivat saada viruksen kuoren putoamaan, mikä vaikuttaa tarttuvuuteen. Kapsidin koosta, paksuudesta ja geometriasta riippuen viruskapsidi voi olla hauras tai päinvastoin, se kestää korkeita paineita. Jotkut vaipalliset virukset, kuten influenssavirukset, ovat joustavia mekaaniselle rasitukselle ja kestävät suuria muodonmuutoksia. Toisaalta leikkausvoima voi aiheuttaa vähemmän vastustuskykyisten virusten, kuten retrovirusten, kuoren putoamisen, mikä vaikuttaa viruksen tarttuvuuteen.

Solunulkoiset verhokäyrän VLP:t ovat myös erittäin haavoittuvia. Keskipakoprosessissa syntyy suuria leikkausnopeuksia, pääasiassa tulo- ja poisto-osissa (suuret leikkausnopeudet syntyvät kaasun ja nesteen rajapinnassa). Kun virus puhdistettiin gradienttisentrifugoinnilla, joidenkin retrovirusten transduktiokyky heikkeni merkittävästi. Keskipakoerotusta suunniteltaessa on otettava huomioon viruspartikkelien suhteellinen epästabiilisuus leikkausvoimien suhteen. Keskipakovoima ei ole ainoa lähde leikkausshokkia, tärkeämpää on laitteiden suunnittelu, erityisesti tuonnissa ja viennissä on myös merkittävä leikkausshokki. Erot eri mittakaavojen suunnittelussa voivat johtaa eroihin leikkausherkkien virusten saannossa ja talteenotossa eri mittakaavassa.

Leikkausherkät virukset tulee suunnitella huolellisesti, koska leikkausjännityksen suuruus ja rasitukselle altistumisaika (kierrätyksen vuoksi) voivat olla korkeita. Leikkausherkille viruksille avoimen piirin laitteet (onttokuitu- tai avoimet levylaitteet) ovat edullisia vähentämään turbulenssia ja leikkausvoimia syöttökanavassa.

Toimintaparametrien valinnan tulisi myös minimoida viruspartikkeleille aiheutuva vahinko: alhainen poikkivirtaus, keskimääräinen transmembraanipaine (TMP) ja lyhyt käsittelyaika.

Kalvokontaminaatio korkeassa paineessa johtaa viruksen tarttuvuuden menetykseen, mahdollisesti johtuen voimista, jotka voivat vaikuttaa viruksen vaippaan. Kalvopohjainen erottelu perustuu kokoon, ja suurimolekyylipainoisten virusinhibiittoreiden ja viruspartikkelien kerääntyminen voi vähentää virusvektorien tarttuvuutta.

Leikkausherkkien virusten hajoamista syväsuodatuksen aikana ei ole dokumentoitu laajasti. Virusten häviäminen syväsuodatuksessa johtuu useimmiten vangitsemisesta, adsorptiosta tai tuotteen ajasta ja lämpötilasta riippuvaisesta viruksen hajoamisesta. Itse asiassa, vaikka mekaanista rasitusta voi esiintyä NFF-järjestelmissä, NFF-tuotteiden altistusaika leikkausvoimalle on hyvin lyhyt muihin teknologioihin verrattuna, koska NFF-tuotteissa esiintyy nopeaa kerta-ajoa.

 

2.2.2.3 Leikkaus aukon koon mukaan

Virukset, joiden koko on yli 100 nm, voidaan säilyttää poistamalla mykoplasma tai steriilit kalvot (0,22 μm ja alle). Tässä tapauksessa on kiinnitettävä erityistä huomiota suodattimien valintaan. Mikrosuodatuksen TFF-vaiheissa 0.45 μm tai 0,65 μm kalvot ovat edullisia hyviksi tuotekanaviksi. NFF-monivaihesuodatuksessa tihein kerros on suurempi tai yhtä suuri kuin 0,45 μm. Syväsuodatinta valittaessa tulee olla varovainen, sillä joissakin syväsuodatinlaitteissa voi olla kalvokerros, mikä voi johtaa tuotteen häviämiseen retentiokäytön takia. Viruksen aggregaatio vaikuttaa negatiivisesti viruksen tuotantoon ja tehostaa viruksen pidättymistä viruksen koon vuoksi.

Andren ja Champluvierin patentin mukaan homogenisointi voi estää tai rajoittaa suodattimen tukkeutumista pienentämällä aggregaatin kokoa, jolloin saadaan suurempi saanto. Homogenointi paransi myös sadon suodatuskapasiteettia, joka kasvoi 24-3 kertaa.

Liian paljon epäpuhtauksia voi häiritä viruksen palautumista. Epäpuhtaudet pyrkivät tukkimaan suodattimen, ja tukkeutuneet kalvohuokoset voivat heikentää viruksen kulkunopeutta. De Vochtin ja Veenstran patentissa mainitaan, että korkean solutiheyden Per. Keräys TFF:llä ({{0}}.65 tai 0.2 μm kalvo) johti adenoviruksesta vapaaseen virukseen. Toipuminen voidaan saavuttaa poistamalla isäntäsolun DNA selektiivisellä saostuspoistolla ennen 0,65 μm:n TFF-vaihetta. 70 % adenoviruksista.

 

 

2.3 Tapaustutkimus: Virusrokotteen selkeyttämisen optimointi

Vuoden 2011 kansainvälisessä biologisten prosessien konferenssissa Sanofi Pasteur esitteli rationaalisen lähestymistavan seulontasuodattimiin uusien selkiytyneiden sekvenssien kehittämiseksi ehdokasvirusrokotteita varten. Tutkimuksen tavoitteena on ratkaista solu- ja virusviljelyprosessien optimoinnin ongelmat. Ylävirran prosessiin tehdyt muutokset johtivat 20 %:n tuottohäviöön ja ennenaikaiseen suodattimen kontaminaatioon selkeytysvaiheen aikana, mikä ei johtanut mittakaavan kasvuun. Vankan ja skaalautuvan selkeytysvaiheen aikaansaamiseksi vaadittiin suodatinsekvenssin täydellinen uudelleenkehitys viruksen talteenottoasteen ollessa yli 85 %.

Based on internal experience and scientific publications, the team selected 27 filters for an initial screening study. Small scale virus adsorption tests were performed on various filter media (polypropylene, nylon, cellulose ester, glass fiber, charged adsorption filter) and structures (pleated or deep filter). The virus yield was measured by ELISA and the clarifying efficiency of the preselected filtrate was compared by checking the reduction of turbidity. Preliminary screening studies showed that nylon and charged filters retained viral particles and virus recovery. Ten percent. The virus recovery rate of polypropylene and polyether sulfone filter was >. 80 %. Selluloosaesteri- ja lasikuitusuodattimien talteenottoaste riippuu suodattimen arvioinnista (20 % tai 90 %).

Toisena vaiheena Sanofi Pasteur arvioi useita yhdistelmiä (vaiheen 2 tai vaiheen 3 sekvenssit) seitsemästä seulontatutkimuksessa esivalitusta suodattimesta. Vakiovirtauksen luokitustesti suoritettiin pienellä suodattimella. Lisäksi tässä kokeessa käytettiin suurempaa saantoa kuin seulontatutkimuksessa. Viruksen palautumisen ja suodatuskapasiteetin tulosten perusteella ryhmä valitsi kaksi parasta yhdistelmää jatkotutkimuksiin.

- Sekvenssi 1 (Vaihe 2): 30 μm nimellismitoitettu taitettu polypropeeniesisuodatin, jota seuraa selluloosaesteri- ja lasikuituyhdistelmämonikerrossuodatin (huokoisuus 1/0,5 μm)

- Sekvenssi 2 (vaihe 3): sama esisuodatin (30 μm:n nimellinen polypropeenisuodatin), jota seuraa monikerroksinen polypropeenisuodatin ja lopuksi epäsymmetrinen polyeetterisulfonikalvo.

 

The robustness of these two clarified sequences has been challenged by repeated constant flow sizing experiments with different harvest batches. While both potential sequences demonstrated enhanced capabilities compared to the reference sequence, only sequence 1 achieved virus recovery objectives (>85 %), kuten kuvassa 1 näkyy.

Kuva 1 Keskimääräinen viruksen palautus kussakin suodatusvaiheessa. Stabiilisuustutkimukset arvioitiin kolmelle suodatussekvenssille, joista vain sekvenssi 1 käyttäen 30 μm:n nimellismitoitettua taitettua polypropeenia ja 10/0,5 μm selluloosaesteri- ja lasikuitusuodatinta saavutti yleisen talteenottotavoitteen. .

Sentrifugointi arvioitiin myös ensisijaiseksi selkeytysvaiheeksi, jota seurasi lopullinen {{0}},45 μm:n suodatus. Useita nopeus/kesto-pareja testattiin. Vaikka 0,45 μm:n suodatusnopeutta nostettiin kaksinkertaiseksi, lopullinen saanto oli pienempi kuin tavoite 85 %. Tämän seurauksena sentrifugointia ei ole tutkittu enempää.

Lopuksi polypropeeni- ja lasikuitusuodatussekvenssien suorituskyky arvioitiin suuremmassa mittakaavassa (160 litran bioreaktorin koko). Suodatinjärjestys on esitetty kuvassa 2.

Kuva 2 selventää suodatinyhdistelmää ja graafisesti merkkijonon askeltuoton. Juna A on perinteinen prosessi ja juna B on optimoitu prosessi. Optimoitu sekvenssi B voi pienentää esisuodatusaluetta 3 kertaa, peruuttaa välisuodatusvaiheen ja pienentää lopullista suodatusaluetta 10 kertaa, mikä lisää maailmanlaajuista viruksen talteenottoa 3 %.

Useat erät selkeytettiin onnistuneesti ilman merkkejä suodattimen tukkeutumisesta, prosessiaika tuotantorajojen mukainen ja virussaanto > 85 prosenttia. Selkeytysvaiheen optimoinnilla ei ollut vaikutusta jatkovaiheisiin ja rokotteen tärkeimpiin laatuominaisuuksiin. Siksi valittua selkeytyssekvenssiä käytettiin rokotteen valmistusprosessissa (1000 litran kokoinen bioreaktori) ja suorituskyky varmistettiin onnistuneesti.

 

03 Bakteerirokotteiden selkeyttäminen

3.1 Huomioitavaa bakteerirokotteiden selventämiseksi

Medical Thesaurus (2015) mukaan bakteerirokote määritellään laimennettujen tai tapettujen bakteerien tai niiden antigeenisten johdannaisten suspensioksi, jota käytetään immuunivasteen indusoimiseen bakteerisairauksien ehkäisyyn tai hoitoon. Yleisemmin bakteerirokotteet voidaan jakaa neljään alaluokkaan aktiivisen antigeenin tyypin perusteella. Tämä agentti voi olla:

- Tappaa tai heikentää koko elävää bakteeria. Tunnetaan myös nimellä BCG-rokote.

- Antigeenideterminanttien puhdistus (alayksikkörokotteet). Pernaruttorokote tai soluton hinkuyskärokote.

- Bakteerimyrkyt (toksoidit). Kurkkumätä- ja tetanustoksoidit.

- Plasmidi (pDNA).

Perheen tuotteiden laajan heterogeenisyyden vuoksi prosessin alku- ja loppuvaiheen haasteet riippuvat suurelta osin valmistettavan rokotteen tyypistä. Siksi alkuperäisen fermentaatiovaiheen jälkeen voidaan puhdistaa tai puhdistaa, jotta selkeytysvaihe voidaan suorittaa.

 

3.2 Bakteerirokotteen selvitysstrategia

3.2.1 Toksoidi

Kaksi yleisintä rokotekäyttöön tarkoitettua toksoidia ovat kurkkumätä ja tetanus, joita tuottavat Corynebacterium diphtheriae ja Clostridium tetani. Molempien rokotteiden tuotantoa koskevat tiukat viranomaisvaatimukset. WHO:n teknisessä raportissa ja sen liitteissä esitetään selkeät suositukset tetanus- ja kurkkumätärokotteiden laadun, turvallisuuden ja tehokkuuden varmistamiseksi. Molempien rokotteiden valmistukseen sovelletaan yleisiä hyviä valmistuskäytäntöjä, ja työntekijöiden on oltava asianmukaisesti koulutettuja ja saatava tehosterokotus molempia tauteja vastaan.

GMP edellyttää ehdottomasti, että lopputuotteen puhtaus ja laatu on osoitettava. WHO:n ja EP:n mukaan lopullisen tetanusrokotteen tehokkuus on määritettävä vertaamalla in vivo tai mihin tahansa muuhun todistettuun menetelmään sopivaan vertailuaineeseen, joka on kalibroitu kansainvälisissä yksiköissä kansainvälisen tetanustoksoidistandardin mukaisesti. Päivitetyt tehokkuusvaatimukset julkaistiin vuonna 2011, ja ne voivat vaihdella arviointimenetelmän mukaan. Jokaisen rokote-erän turvallisuus (toksiiniton ja korjaava myrkyllisyys) on myös osoitettava. Lopuksi on puututtava rokotteiden vakauteen, erityisesti reaaliajassa.

 

3.2.2 Plasmidi-DNA-rokote

Plasmidi-DNA-rokotteita käytetään eläinten terveyteen, ja useat ihmiskäyttöön tarkoitetut plasmidi-DNA-rokotteet ovat eri kehitys- ja kliinisessä arvioinnissa. E. coli -fermentaation jälkeen bakteerit kerätään ja katkaistaan ​​plasmidi-DNA:n vapauttamiseksi.

Solujätteen poisto suoritetaan yleensä sentrifugoimalla tai suodattamalla. Aihetta on käsitelty laajasti viimeaikaisissa julkaisuissa. Tässä julkaisussa nykyiset ylävirran, alavirran ja formuloinnin pDNA-prosessit ja haasteet.

Kirjoittajat antavat myös käsityksen aukoista tyypillisen pDNA-valmistusprosessin jokaisessa vaiheessa ja mahdollisista tulevaisuuden innovaatioista ja/tai nykyisistä teknologisista puutteista, jotka voivat johtaa prosessin lisäoptimointiin.

Plasmidi-DNA-rokotteet valmistetaan kahdessa vaiheessa. Ensinnäkin bakteerisolut poistetaan viljelyväliaineesta ja toiseksi solujätteet solujen hajoamisen jälkeen. Mittakaavasta riippuen solut kerätään käyttämällä sentrifugointia tai TFF-mikrosuodatusta. Levypino-sentrifugi ruiskutetaan ajoittain suurella nopeudella, ja superkierteisten plasmidien saanto on huono purkamisen aikana tapahtuvan leikkausvaurion vuoksi. Jos sentrifugointia on käytettävä, kiinteä kulhosentrifugi on paras. Avokanavaiset, litteät TFF-laitteet, joissa on 0,1 tai 0,2 μm:n mikrosuodatuskalvot tai onttokuitulaitteet, voivat toimia hyvin.

Koska onttokuitulaitteilla on suuri kiinteä kuormituskyky, ne ovat joskus etusijalla. Tyypillisesti nämä prosessit toimivat 3-5-kertaisella pitoisuudella, jota seuraa 3-5 transsuodatustilavuutta. Leikkauksen vähentämiseksi ja kalvon polarisaation säätelemiseksi paremmin, läpäisyn säätötoiminnot ovat erittäin suositeltavia. Vaikka sentrifugit ovat kustannustehokkaampia suuressa mittakaavassa kaupallisissa toimissa, pienemmät prosessit käyttävät yleensä suodatusta siirrettävyyden ja käytön helppouden vuoksi.

Flokkulantia on käytetty helpottamaan käsittelyä, mutta se voi johtaa tuotteen hävikkiin. Jotkut suosittelevat myös inerttien piimaahiukkasten käyttöä, minkä jälkeen pussisuodatusta.

Cell lysis produces viscous products, including large particles, cell fragments, soluble impurities, fine colloidal particles, and pDNA. Due to the complexity of the material, removing such fine solids is a difficult separation. Gradient density deep filter or open hole structure (>0,45 m) kalvosuodattimet poistavat hyvin solujätteet. Solujätteen voimakkaan tukkeutumisen vuoksi alhainen virtaus tai matalapainesuodatus on edullinen. Tässä vaiheessa on käytetty Tff-pohjaisia ​​mikrosuodattimia ja teollisen mittakaavan pussisuodattimia. Staattinen (sekoitusastiassa) ja jatkuva (käyttämällä staattista sekoitinta) krakkaus vaatii erilaisia ​​suodattimia.

 

3.3 Tapaustutkimus: sentrifugoinnin, NFF- ja TFF-menetelmien tehokkuuden vertailu jäykkäkouristustoksiinien puhdistamisessa

Muniandi et ai. vertaili kolmea eri menetelmää tetanustoksiinien ja -toksoidien puhdistamiseksi käymisnesteistä, nimittäin sentrifugointia, syväsuodatusta (NFF) ja TFF:ää. Testimateriaali tuotettiin 4 00 litran fermentorissa käyttäen modifioitua Miller (MMM) -alustaa. Sentrifugointitutkimuksessa solut erotettiin sydämestä nopeudella 4000 RPM 6 × 1 litran astiassa 60 minuutin ajan. Supernatantista otettiin näytteitä toksoidin palautumisen havaitsemiseksi. Syväsuodatus käyttää 0,45 μm ja 0,22 μm syväsuodattimia, jotka sisältävät piimaata ja selluloosaa käymisliemen kirkastamiseksi. Prosessi suoritetaan 35 asteen ja 12 psi:n lämpötilassa.

Avoin litteä TFF-moduuli on lämpösidottu 0,22 μm PVDF-kalvoon TFF-menetelmällä. TFF-pohjainen selkeytysprosessi suoritettiin ristivirtausnopeudella 2000 l/h 23 asteessa, ja kirkastettu suodos konsentroitiin ristivirtausnopeudella 1000 l/h 25 asteessa käyttämällä tavanomaista TFF-kerroksista 30 kD PES-kalvoa. Kirkastettu lihaneste (noin 6 l) konsentroidaan 10 kertaa tässä ultrasuodatusprosessissa. Tetanustoksoiditestit suoritettiin tiivistetyillä pidätinnäytteillä tuotteen saannin arvioimiseksi.

Syväsuodatus johti tuotteen talteenottoasteeseen noin 89 %, kun TFF-yksiköt tuottivat yli 97 % tuotteen talteenottoasteeseen. Mikrosuodatus- ja ultrasuodatusprosessit tuottavat johdonmukaisesti suuremman tuotteen talteenoton kuin NFF-prosessi. Nämä tulokset perustuvat flokkulaatiotesteihin (Lf).

 

04Polysakkaridirokotteiden selkeyttäminen

4.1 Polysakkaridirokotteen selkeyttämisen harkitseminen

Sekä kytkemättömien/vapaiden polysakkaridirokotteiden että kytkettyjen polysakkaridirokotteiden tuotantoprosessi alkaa isäntäbakteerien viljelyllä fermentorissa. Fermentoinnin lopussa bakteereja voidaan käsitellä puhdistusaineilla, kuten DOC (natriumdeoksikolaatti), Triton®X-100 tai muilla sopivilla reagensseilla bakteerien tuhoamiseksi ja polysakkaridien vapautumisen edistämiseksi. Suuren akun kapasiteetin vuoksi kerääminen suoraan NFF:n kautta ei ole taloudellisesti kannattavaa, koska läpijuoksu voi olla hyvin alhainen. Siksi ihanteellinen valinta on käyttää sentrifugia solupaakkujen erottamiseen. Myös TFF-mikrosuodatussarjaa voidaan käyttää. Soluton keskus/tunkeutumisaine, joka sisältää kiinnostavan polysakkaridin, kirkastetaan edelleen NFF-syväsuodatusjärjestelmällä, jota seuraa biobattered-suodatus, ja sitten jatketaan alavirran käsittelyyn lisäpuhdistusta varten.

 

4.2 Polysakkaridirokotteen selkeytysstrategia

4.2.1 Ensimmäinen selvennysmenettely

Sentrifugointi on yksi yleisimmistä tekniikoista solujen erottamiseksi käymisnesteistä. Asteikosta riippuen voidaan valita jatkuva sentrifugointi tai eräsentrifugointi. On tärkeää huomata, että sentrifugointiolosuhteiden ja niiden toiminnan asianmukainen optimointi on olennaista onnistuneelle jatkopuhdistukselle. Tiettyä TFF-kalvoa ja huokoskokoa valittaessa on tärkeää pitää mielessä polysakkaridien molekyylipaino, koska polysakkaridit ovat usein suuria ja rakenteellisesti monimutkaisia ​​ja joiden molekyylipainot vaihtelevat noin 500kDa. yli 1000 kDa. Suuren avoimen huokoskoon ansiosta 0,22 μm, 0,45 μm, 0,65 μm MF-kalvojen käyttö voi varmistaa PS-molekyylien onnistuneen talteen osmoottisessa liuoksessa.

 

4.2.2 Toissijainen selvennysmenettely

Toissijaiseen selkeytysvaiheeseen pääsevän soluttoman fermentointiliuoksen kirkkaus/sameus riippuu spesifisistä bakteereista, katkaisutyypistä, yksittäisestä seerumityypistä ja ensisijaisessa selkeytysvaiheessa käytetystä tekniikasta. Keskuksen sameus voi vaihdella noin 50 - 150 NTU. Kyllästetystä piimaasta, jossa on täytettyjä selluloosakuituja, valmistettu positiivisesti varautunut fraktiotiheyssyväsuodatin voidaan käyttää kirkastamaan ja vähentämään sen sameutta arvoon < 5NTU.

Tämän syväsuodattimen tilavuusvirta voi vaihdella noin 150 l/m3 - 250 l/m3. Tyypillisesti kirkastettu tuoteliuos suodatetaan seuraavan 0,45 μm:n biotuetun pelkistyslaadun tai 0,22 μm:n steriloidun kalvon läpi jäljellä olevien soluhiukkasten, kolloidien ja mahdollisten mikro-organismien poistamiseksi.

 

4.3 Tapaustutkimus: Streptococcus pneumoniae -fermentialiemen keskuksen selkeyttäminen sentrifugoinnin jälkeen

Solut erotettiin lisäämällä {{0}},1 % (v/v) tyypin 8 Streptococcus pneumoniae -fermentointilientä (20 I) jatkuvalla sentrifugoinnilla. Kokoelman keskiosa suodatetaan kahden erillisen positiivisesti varautuneen ja piimaapohjaisen syväsuodattimen läpi, jotka sisältävät selluloosakuituja. Yksittäinen syväsuodatin suodos suodatettiin sitten biologisesti kuormitetun pelkistysluokan PVDF 0,45 μm kalvon läpi. Kaikki suodatustestit suoritettiin vakiovirtaustilassa peristalttisilla pumpuilla. Suodatustestit, joissa käytettiin ladattua syväsuodatinta ja Streptococcus pneumoniae serotyypin 8 fermentointilientä, johtivat sameuden putoamiseen noin 120 NTU:sta 3 NTU:hen. Testit suoritettiin virtausnopeudella 140 150 l/m2/h ja päätepisteen paine-erolla 20-25 psi, tilavuusvirtauksella noin 180-200 l/m2.

Samanlaiset suodatustestit suoritettiin Streptococcus pneumoniaen serotyypin 19A fermentaatioliemelle. Sentrifugoitu 19 A neste kirkastetaan ladatun syväsuodattimen läpi, mikä vähentää sameutta noin 40 NTU:sta 3 NTU:han. Testit suoritettiin vakiovirtausnopeudella, joka oli noin 140-160 L/m2/h, ja tilavuusvirtaus 200-230L/m2 saavutettiin noin 15 psid:n päätepaineella. Suodatuksen arviointitestien aikana kerättyjen tuotenäytteiden HLPC-analyysi ei osoittanut merkittävää saantohäviötä syväsuodatuksella tai 0,45 μm (tai 0,22 μm) kalvoilla.

 

05 Johtopäätös

Selkeytysprosessien kehittäminen edellyttää useiden yksikköprosessien, kuten sentrifugoinnin, TFF-MF:n, syväsuodatuksen ja aseptisen suodatuksen yhdistämistä. Selkeytysprosessin optimointi edellyttää ymmärrystä siitä, miten eri yksiköiden toiminnot vaikuttavat toisiinsa. Haasteena on valita teknologiat ja työkalut (laitteet ja kalusteet) vastaamaan yhä monimutkaisempia vaatimuksia nykypäivän tehokkaammissa bioreaktoreissa tuotetuille prosessinesteille. Ylävirran tuottavuuden (virustiitteri, solutiheys jne.), solujätteen ja solujen hajoamistuotteiden lisääntyminen lisää selkeytysprosessin vaikeutta ja sekoittaa erotus- ja suodatuslaitteiston valinnan.

Laitteiston suunnittelu, helppokäyttöisyys ja puhtaus tulee ottaa huomioon prosessimittakaavan valinnassa. Tämä varmistaa tehokkaan muuntamisen ja käyttäjän turvallisuuden, kun he käsittelevät käytöstä poistettuja suodattimia. Selkeytysprosessin kehittämiseksi selkeytysvaiheiden vahva integrointi on tärkeää, jotta varmistetaan, että alkupään sadon käsittely on kustannustehokasta. Valikoima suodatinyksiköitä on helposti saatavilla helpottamaan laboratoriotestausta, pilottituotantoa ja täysikokoista käsittelyä. Toteuttamalla hyvin suunnitellun laajennustyösuunnitelman, jossa arvioidaan useita selkeytysvaihtoehtoja, selkeytyssuodattimet voidaan valita ja mitoittaa luottavaisesti, jotta ne suojaavat yksikön loppupään toimintoja ja vähentävät samalla käyttökustannuksia.

Rokotteen selkeyttäminen tuo mukanaan useita haasteita. Tyypillisesti suodatusprosessi on mukautettava tuotantojärjestelmään, inaktivointi- tai lyysiaineeseen ja antigeenin esittelyyn, ei välttämättä rokotteisiin. Perinteisissä rokoteprosesseissa käytetään tyypillisesti sentrifugointia rokotteen aluksi kirkastamiseksi. Nykyaikaiset rokotteet, joissa on useita teknologia-alustoja ja pienemmät prosessointivolyymit, tekevät rokotteista sopivampia kalvopohjaisten tekniikoiden kirkastukseen. Hiljattain kehitetyt rokotteet, joissa käytetään nykyaikaisia ​​solulinjoja ja ilmentämisjärjestelmiä ja joissa käytetään tarkemmin määriteltyjä soluviljelyolosuhteita, tekevät monista rokoteprosesseista suotuisampia suodatusta varten.

 

Kuitenkin rokotetuotteiden antigeenisen komponentin tai "kohdeantigeenin" heterogeenisyys lisää suodatuksen selkeyttämisen monimutkaisuutta. Antigeenit vaihtelevat kooltaan, pintakemialtaan ja varaukseltaan. Nämä ominaisuudet vaikuttavat antigeenien saantoon ja talteenottoon. Rokotteet asettavat ainutlaatuisia haasteita selkeyttämiselle pääasiassa niiden makromolekyylien koon vuoksi. Tämä yhdistettynä selkeyttämistä koskeviin kykyongelmiin lisää prosessien kehittämisstrategioiden ohjauksen tarvetta.

Rokotteen valmistuksen kaupallisen mittakaavan koko ja mittakaava vaikuttavat merkittävästi kirkastusteknologian valintaan. Koska se sijaitsee prosessin ylävirran puolella, asianmukainen selkeytyksen optimointi on ratkaisevan tärkeää loppupään yksikön toimintojen onnistumiselle, mikä maksimoi prosessin tuoton, talteenoton ja kestävyyden. Vaikka sentrifugointi on edelleen varteenotettava tekninen vaihtoehto primääriselkeytykseen, avoimen kanavan mikrosuodatusyksiköt (TFF) primääriselkeytykseen ja hienot syväsuodattimet tai kalvosuodattimet toissijaiseen selkeytykseen ovat saamassa hyväksyntää rokoteteollisuudessa. Tämä muutos johtuu nopeamman käsittelyn, nopean prosessikehityksen, kannettavien prosessien ja kertakäyttöisten toteutusten tarpeesta. NFF tarjoaa taloudellisen prosessin, joka sopii pieniin ja suuriin kertakäyttöisiin vaihtoehtoihin. Muuttuvat sääntelytarpeet johtuen gammasäteilytyksen esiaseptisten laitteiden tai autoklavointiin suunniteltujen moduulien saatavuus edistää NFF- tai TFF-pohjaisten teknologioiden nopeampaa sopeutumista.

Moniin klassisiin rokotusprosesseihin liittyy selkeytysyksiköiden toimintojen kehitys, mikä johtuu suurelta osin lainsäädännöllisistä rajoituksista ja niihin liittyvistä uusista validoinnista ja uudelleen toimittamisesta tai kliinisistä kokeista aiheutuvista korkeista kustannuksista. Suodatukseen perustuvaa selkeytysmenetelmää käyttävää alustaprosessia on käytetty laajasti useissa biologisissa aineissa suurella menestyksellä. Tässä asiakirjassa hahmotellut esimerkit ja tapaukset osoittavat, että rokotteiden valmistajilla on potentiaalia saavuttaa tämä stabiilisuus, taloudellinen elinkelpoisuus ja kertakäyttöinen hyöty noudattamalla mallipohjaista lähestymistapaa.

Muita suodatuksen etuja sentrifugointiin verrattuna ovat leikkausherkät virukset tai virukset, jotka pyrkivät kerääntymään ilman rajapinnalle. Kun laitevalmistajat tuovat markkinoille uusia tuotteita, rokotevalmistajat ovat jatkossakin paremmin valmistautuneita selkeytysprosessiin.

 

Guidling Technologylla on lokalisointipiirin ensimmäisenä yrityksenä kertynyt riittävästi relevanttia kokemusta rokotteen selkeytyksestä. Guidling Technology on biofarmaseuttiseen ja soluviljelyyn, puhdistukseen ja erotukseen keskittyvä kehitys- ja tuotantoyhtiö. Tuotteita käytetään laajalti biolääketieteessä, diagnoosissa, teollisessa nesteiden suodatuksessa, havaitsemisessa, selkeytyksessä, puhdistus- ja väkevöintiprosessissa; Guidling on menestyksekkäästi kehittänyt ultrasuodatussentrifugiputken, ultrasuodatus/mikrosuodatuskalvokasetin, viruksenpoistosuodattimen, tangentiaalivirtauksen suodatinlaitteen, syvän kalvopinon jne., jotka täyttävät täysin biofarmaseuttisen ja soluviljelyn sovellusskenaariot.

Kalvojamme ja kalvosuodattimiamme käytetään laajasti esisuodatuksen, mikrosuodatuksen, ultrasuodatuksen ja nanosuodatuksen tiivistämiseen, uuttamiseen ja erottamiseen. Laaja valikoimamme pienistä kertakäyttöisistä laboratoriosuodattimista tuotantotyyppisiin suodatusjärjestelmiin, steriiliystestaukseen, fermentointiin, soluviljelyyn ja muuhun, voivat vastata testauksen ja tuotannon tarpeisiin.