Verituotteiden inaktivointi- ja viruksenpoistotekniikka

Verituotteet ovat "plasmaproteiinikomponentteja tai verisolukomponentteja, kuten ihmisen veren albumiini, ihmisen immunoglobuliini, ihmisen hyytymistekijä (luonnollinen tai rekombinantti) punasolukonsentraatti jne., jotka on erotettu terveestä ihmisen plasmasta tai spesifisesti immuuni-ihmisen plasmasta, puhdistettu tai valmistettu yhdistelmä-DNA-tekniikalla diagnoosia, hoitoa tai passiivista immunoprofylaksiaa varten". Verivalmisteilla on tärkeä rooli lääketieteellisissä hätätilanteissa, sotavammojen pelastamisessa sekä joidenkin tiettyjen sairauksien ehkäisyssä ja hoidossa.

 

Sääntelytausta

Turvallisuusvarmistuskäytäntöjen on varmistettava, että lopullinen lääke on turvallinen sääntelyviranomaisille ja viime kädessä potilaille ja yleisölle. Kansainvälinen koordinaatiokonferenssi (ICH 1998) julkaisi 1990-luvulla "Q5A: Ihmis- tai eläinperäisten solulinjojen bioteknisten tuotteiden virusturvallisuusarviointi" (Q5A: Viral Safety Assessment), joka luo maailmanlaajuisen standardin virusturvallisuudelle.

ICH Q5A kuvaa monitasoista järjestelmää testaamiseen ja vahvistamiseen tämän tavoitteen saavuttamiseksi. Testiohjelma keskittyy solupankkien, raaka-aineiden ja bioreaktorien talteenottoon, jota täydentää tuoteriskianalyysi. Testauksen lisäksi ICH Q5A edellyttää, että loppupään dekontaminaatio arvioidaan vikaturvallisena toimenpiteenä, kun epäpuhtauksia ei havaita ylävirtaan. Puhdistuksen tarkastus varmistaa, että jos jokin virus kiertää testausohjelman, se voidaan poistaa ja/tai inaktivoida ennen kuin se päätyy lopulliseen lääketuotteeseen.

 

Taustaa yleiseen virusturvaohjelmaan

Nykyaikaisessa bioteknologian valmistuksessa (tai bioprosessoinnissa) koko puhdistetussa sekvenssissä on yleensä kolme tai neljä yksikköoperaatiota, jotka kykenevät poistamaan tai inaktivoimaan viruksen. Tämä sisältää tietyt kromatografiset vaiheet (kuten proteiini A tai anioninvaihto), alhaisen pH:n tai detergenttien viljelyn ja virusretentiosuodattimet. Kaikki nämä vaiheet eivät poista tai inaktivoi tehokkaasti kaikkia viruksia.

Esimerkiksi alhaisen pH:n viljelmä on yleensä tehoton vaipattoman viruksen inaktivoinnissa, mutta se toimii hyvin vaipallisen viruksen inaktivoinnissa. Tietyissä käyttöolosuhteissa anioninvaihtokolonni ei ehkä pysty sitomaan ja poistamaan neutraaleja isoelektrisiä viruksia tuotevirrasta, mutta se on tehokas happamia viruksia vastaan.

Se on yhdistelmä kolmesta neljään itsenäistä ja ortogonaalista yksikköoperaatiota, jotka yhdessä varmistavat bioteknologiatuotteiden virusturvallisuuden.

 

Yleisesti oletetaan, että vankka, tehokas ja luotettava prosessointivaihe pystyy poistamaan tai inaktivoimaan suuren määrän viruksia (määritetään yleensä vähintään 4 log10:ksi, jossa logaritmisen vähennysarvo tai LRV lasketaan log10:nä kokonaismäärästä syötteessä olevien virusten määrä jaettuna tulosteen virusten kokonaismäärällä). LRV:tä ei kuitenkaan voida käyttää yhtenä absoluuttisena askeleen tehokkuuden mittana. Tiedot voivat olla alustavia. Se on helppo mallintaa, suhteellisen epäherkkä prosessiolosuhteiden muutoksille ja tehokas useita viruksia vastaan ​​(WHO 2004).

Virussuodatus on laajalti tunnustettu niin tehokkaaksi ja tehokkaaksi prosessivaiheeksi, ja se on keskeinen osa kokonaisstrategiaa, jolla pyritään minimoimaan eksogeenisten ja endogeenisten viruspartikkelien riski bioteknologiatuotteiden valmistuksen aikana.

Virussuodattimet toimivat usein vahvojen, kokoon perustuvien säilytysmekanismien kautta. Tämän tehokkaan vaikutusmekanismin perusteella virussuodattimet tarjoavat kromatografisia vaiheita todennäköisemmin ennustettavan viruksen pidättymisen useille viruksille. Tämä johtuu siitä, että eri virusten fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien erot ja toimintaolosuhteiden säätelemät virus-hartsi-vuorovaikutukset eivät todennäköisesti vaikuta suodattimeen. Siksi virussuodatusvaihetta käytetään yleisesti hyvin suunnitelluissa terapeuttisissa rekombinanttiproteiinien puhdistusprosesseissa (EMEA 1996), joilla on myös osoitettu olevan vankka suorituskyky plasmankäsittelyteollisuudessa.

 

Verituotteet ovat kuitenkin kuin kaksiteräinen miekka, joka paitsi säästää tuhansia ihmishenkiä, myös mahdollistaa sairauksien leviämisen ja uhan ihmisten terveydelle. Tilastojen mukaan vuosina 1977–1984 ainakin 30,000 veren saajaa Yhdysvalloissa sai AIDS-viruksen tartuttamaa verta. Vuonna 1985 1 200 kolmesta hemofiliasta Ranskassa sai AIDSin verensiirron tai verivalmisteiden kautta.

Maailman terveysjärjestön mukaan 5–10 % AIDS-tartunnoista maailmanlaajuisesti johtuu AIDS-tartunnan saaneen veren tai verivalmisteiden siirroista. Ensimmäinen aids-tapaus Kiinassa tartutettiin käyttämällä tuontiverivalmisteita, joissa oli AIDS-virus. Lisäksi on raportoitu hepatiitti B- ja C-tautien tarttumista veren ja verivalmisteiden siirron seurauksena.

 

1. Tärkeimmät verivalmisteiden välityksellä leviävät virukset ja niiden ominaisuudet

Veren ja verituotteiden välityksellä tarttuvia viruksia on monenlaisia, kuten taulukko 1 osoittaa. Niiden joukossa kotimaiset ja ulkomaiset lääketieteen piirit ovat olleet huolissaan HIV:stä, HBV:stä ja HCV:stä korkean tartuntaprosentin ja vakavien haittojen vuoksi.

Koska verellä ja verituotteilla on mahdollisuus levittää viruksia, se on vaikuttanut vakavasti sen käyttöön sairauksien ehkäisyssä ja hoidossa. Siksi verivalmisteiden valmistuksessa on lisättävä viruksen inaktivointi- ja poistoprosesseja verituotteiden turvallisuuden varmistamiseksi.

2. Tärkeimmät menetelmät viruksen inaktivoimiseksi ja poistamiseksi

Verituotteiden turvallisuuden takaamiseksi verenluovuttajien valinnan, mahdollisuuksien mukaan immunisoinnin ja kerätyn veren tiukan testauksen ja muiden toimenpiteiden lisäksi verituotteiden inaktivointi ja virushoidon poistaminen on tärkeä linkki, jolla varmistetaan verensiirron turvallisuus. Useita yleisesti käytettyjä ja tehokkaita menetelmiä virusten inaktivoimiseksi ja poistamiseksi kuvataan yksityiskohtaisesti alla.

 

I. Viruksen inaktivointimenetelmät

1. Pasteur-menetelmä

Tämän menetelmän teoreettinen perusta on, että viruksen rakenteen tuhoutumisnopeus on paljon suurempi kuin proteiinirakenteen tuhoutumisnopeus lämpötilan ja toiminta-ajan valinnan kautta. Lähes 50 vuoden kliinisen käytön tulokset ja viimeaikaiset eläinkokeet ovat vahvistaneet, että albumiini liuoksessa 60 asteen, 10 tunnin lämpökäsittelyn eli Pasteur-desinfioinnin jälkeen ei voi inaktivoida vain HBV:tä, vaan myös inaktivoida HCV:tä ja HIV:tä, mikä tekee albumiinista luotettavimman. verituote virusturvassa.

Äskettäin Pasteurin prosessi on laajentunut IVIG-, FVI-, FIX-, fibrinogeeni- ja muiden tuotteiden tuotantoon. Bridonnccu et ai. lisäsi tämän viruksen inaktivointiprosessin matalan lämpötilan etanolin tuotanto-IVIG-prosessiin, toisin sanoen Pasteur-menetelmä toteutettiin olosuhteissa, joissa ei ollut stabilointiainetta, alhainen suolapitoisuus ja happamuus, ja virustiitteri laski 5 log:lla. Simmonds et ai. testattiin Yhdistyneessä kuningaskunnassa kliinisesti käytettävien FVⅢ- ja FIX-konsentroitujen valmisteiden transfuusiovälitteisiä viruksia (TTV) ja havaitsivat, että TTV-havaintoprosentti tuotteilla, joissa ei ollut Pasteur-viruksen inaktivointia, oli 50 % - 75 % ja positiivinen havaitsemisprosentti. tuotteista Pasteur-inaktivoinnin jälkeen oli 0.

TTV-positiivinen osuus oli 27 % 84 hemofiliapotilaalla Yhdistyneessä kuningaskunnassa, jotka käyttivät inaktivoimattomia hyytymistekijätuotteita, kun taas vain yksi 19 potilaasta, jotka käyttivät viruksella inaktivoituja hyytymistekijätuotteita, oli positiivinen, ja positiivinen havaitsemisprosentti oli 5. Siksi viruksen inaktivointiprosessi on erittäin tehokas parantamaan verituotteiden turvallisuutta.

 

2. Orgaaninen liuotin yhdistettynä pinta-aktiiviseen aineeseen (S/D-menetelmä)

This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90 %. Suuri määrä S/D-menetelmällä inaktivoituja verituotteita on osoittautunut turvallisiksi ja luotettaviksi pitkäaikaisen kliinisen käytön ansiosta, joten niitä käytetään laajasti. Tällä menetelmällä ei kuitenkaan ole inaktivointikykyä parvovirus B19, HEV ja muita ei-lipo-päällysteisiä viruksia vastaan.

 

3. Kuivalämmön inaktivointimenetelmä

Kuivalämmön inaktivointi tarkoittaa, että kylmäkuivattu valmiste käsitellään kuumentamalla ja virus tapetaan kuivalla lämmöllä. Yleisesti käytetyt kuivalämpömenetelmät ovat 60 astetta ~80 astetta, 10~72 h lämmitysmenetelmää ja 80 asteen, 72 tunnin käsittelymenetelmää. Jo 1980-luvun alussa oli hyödyllistä kuumentaa FVIII-lyofilisoitua konsentroitua valmistetta ja protrombiinikompleksia 60-80 asteessa 10-72 tuntia. On kuitenkin osoitettu, että tällä menetelmällä ei voida täysin inaktivoida HBV:tä, HCV:tä, HIV:tä. Kuivalämpökäsittely 80 asteessa ja 72 h on osoittautunut tehokkaaksi HBV:n, HCV:n ja HIV:n inaktivoinnissa. Viime aikoina on myös raportoitu 100 asteessa käsitellyistä hyytymistekijöiden lyofilisoiduista valmisteista. Xu Jinbo et ai. käsittelivät IgG:tä 100 asteessa 30 minuuttia ja inaktivoitua vesicular stomatitis virusta 8.2 Log. Jotkut ihmiset pakastavat kuivattua FVIII:aa 68 asteessa 72 tunnin ajan kuivassa tilassa ja kuumentavat sitten 100 asteessa 0,5–1 tunnin ajan. Tämä menetelmä on suhteellisen taloudellinen.

 

4. Fotokemiallinen menetelmä

This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6.6 HV:hen sitoutuneiden solujen logaritmi ja verihiutaleet säilyivät hyvinä 7 päivän toiminnallisen säilytyksen jälkeen in vitro, minkä FDA on hyväksynyt kliinisiin kokeisiin.

Näistä menetelmistä Pasteur-desinfiointimenetelmä ja S/D-menetelmä ovat Yhdysvaltojen FDA:n hyväksymiä ja niitä käytetään laajalti maailmassa. Kuivalämpöinaktivointimenetelmä soveltuu pääasiassa lyofilisoitujen valmisteiden virusinaktivointiin. Fotokemiallisella menetelmällä on voimakas inaktivoiva vaikutus lipidipäällystettyihin viruksiin, ja sitä on käytetty koko plasman virusten inaktivoinnissa Euroopassa, ja sillä on laajat mahdollisuudet virusten inaktivaatioon verisolukomponenteissa. Kaikilla näillä menetelmillä on kuitenkin omat puutteensa, kuten Pasteur-sterilointi ei ole ihanteellinen joidenkin lämmönkestävien virusten inaktivointiin; S/D-menetelmä ei voinut tehokkaasti inaktivoida ei-lipopäällysteistä virusta. Fotokemiallinen menetelmä vahingoitti merkittävästi joidenkin plasman proteiinien aktiivisuutta. Nykyinen seurantatutkimusten kliininen käyttö osoittaa, että mikään virusinaktivointimenetelmä ei voi taata, että verituotteet ovat täysin vapaita virusten leviämisriskistä.

 

I. Viruksenpoistoprosessi

Verituotteiden tuotannossa yksi inaktivointiprosessi ei voi inaktivoida kaikkia viruksia; Lisäksi virus itsessään on heterologinen proteiini, kuten tuotteen syöttäminen aiheuttaa haittavaikutuksia; Samaan aikaan teknisen tason rajoituksista johtuen edelleen on viruksia, joiden ominaisuuksia ei löydy tai ymmärretä, joten olemassa olevat virusinaktivointimenetelmät eivät voi taata näiden virusten inaktivointivaikutusta. Siksi inaktivointi ei yksinään voi taata tuotteen turvallisuutta, ja se on poistettava tuotteesta. Joten virustenpoistotekniikka saa yhä enemmän huomiota. Kaksi yleisesti käytettyä ja tehokasta viruksenpoistoprosessia kuvataan lyhyesti alla.

1. Kromatografinen tekniikka

Kromatografiateknologialla tarkoitetaan eri komponenttien ja kiinteän faasin affiniteetti- tai vuorovaikutuserojen käyttöä eri komponenttien erottamisen saavuttamiseksi. Kehittyneenä teknologiana verituotteiden valmistukseen kromatografialla itsessään on viruksia poistava vaikutus, erityisesti affiniteettikromatografia ja ioninvaihtokromatografia. Ioninvaihtokromatografiassa eluoimalla on viruksenpoistossa etuja penetraatioon verrattuna. Taulukossa 2 esitetään tilastotiedot HAV-poistonopeudesta kromatografialla CSL Companyn albumiinin tuotantoprosessissa Australiassa. Kuten taulukosta 2 voidaan nähdä, ioninvaihtokromatografia ja geelisuodatus ovat tehokkaampia HAV:n poistamisessa kokonaispoistonopeuden ollessa 10,9 log.

FVIII:n tuotannossa Baxter Healtheare suorittaa immunoaffiniteettikromatografian käyttämällä anti-FVIII-vasta-aineella käsiteltyjä geelejä, jotka voivat poistaa (4,2±0.1)login ja (5,3±0.9)login ei- -lipidipäällysteiset virukset, kuten PPV ja HAV, vastaavasti.

 

2. Nanofilmisuodatus

Joillekin viruksille, joilla on pieni pintahalkaisija, kuten HAV ja parvovirus B19, nanokalvosuodatus on tehokkain poistomenetelmä. Se hyödyntää proteiinien ja virusten välistä kokoeroa ja virusten adsorptiota suodatinkalvon kautta virusten eristämiseksi. Sanquin Blood Supply Sitessa Alankomaissa suoritettiin laboratoriotutkimus virusten poistamisesta lisäämällä yksivaiheinen, kaksivaiheinen Planova 15N -nanomembraanisuodatus protrombiinikompleksin tuotantoprosessiin. Havaittiin, että HIV:n, HAV:n ja muiden virusten poistumisnopeudet lisääntyivät eriasteisesti nanomembraanisuodatuksen jälkeen (katso taulukko 3).

Seuraavia ongelmia voi kuitenkin ilmetä, kun tätä menetelmää sovelletaan teolliseen tuotantoon: Ensinnäkin tuotteen korkean viskositeetin ja halkaisijaltaan suurien proteiinien vuoksi suodattimen valitseman kalvon huokoskoon ei tulisi olla liian pieni, rajoittaen siten halkaisijaltaan pienten virusten, kuten HCV:n, poistamista; Toiseksi kalvon huokoskoon hallinnan stabiilius suodattimen tuotantoprosessissa vaikuttaa viruksen poistoon. Kolmanneksi, kun kalvon aukko, joka on pienempi kuin viruspartikkelin halkaisija, tukkeutuu, tuotteen virtausnopeus pienenee, mikä vaikuttaa saantoon. Siksi sellaisten kalvojen valinta, joiden ominaisuudet ja huokoskoko sopivat jalostettujen tuotteiden tarpeisiin, on tärkeä tekijä siinä, pystyykö nanomembraanisuodatus poistamaan viruksia.

 

3. Keskustelu

Verilähteen laadun varmistamisen edellytyksenä on, että viruksen inaktivointi- ja poistoprosessi on tärkeä ja välttämätön keino varmistaa verituotteiden turvallisuus. Vain yhden inaktivoidun virusprosessin käyttö ei voi täysin taata verituotteiden turvallisuutta. Viruksen inaktivointitekniikan perusteella lisättiin viruksenpoistotekniikka, kuten kromatografia ja nanofilmisuodatus, viruksenpoistonopeus nostettiin huomattavasti ja viruksen inaktivointi- ja poistovaikutus parani merkittävästi. Tällä hetkellä Eurooppa on selkeästi ehdottanut, että verivalmisteiden tuotantoprosessissa on käytettävä vähintään yhtä virusten inaktivointia ja poistamista verituotteiden turvallisuuden varmistamiseksi.

Kiinassa useimmat verivalmisteiden valmistajat käyttävät tuotantoprosessissaan vain yhtä inaktivoitua virusprosessia, kuten Pasteur-desinfiointimenetelmää, S/D-menetelmää jne., mutta eivät käytä viruksenpoistoprosessia, joka vaikuttaa vakavasti verituotteiden laatuun. Kiinan liittyessä WTO:hon kotimaisten verituotteiden tuotantoprosessi ja laatustandardit ovat maailman linjassa, muuten se ei voi taata olemassa olevaa kotimaan markkinaosuutta, mutta se ei myöskään voi kilpailla vastaavien tuotteiden kanssa muissa maissa. kansainvälisillä markkinoilla.

Siksi Kiinan verituotteiden valmistajien on parannettava tuotantoprosessia, tehostettava viruksen inaktivointia ja poistamista, jotta tuotteen laatu ja turvallisuus voidaan täysin varmistaa. Siksi kiinalaisten verituotteiden valmistajien trendi on käyttää kromatografiaa verituotteiden puhdistamiseen ja virusten poistamiseen verituotteiden turvallisuuden varmistamiseksi.

 

Tietoja Guidlingistä

 

Guidling Technology on valtakunnallinen korkean teknologian yritys, joka keskittyy biofarmaseuttisiin valmisteisiin, soluviljelyyn, biolääketieteen puhdistukseen ja konsentroimiseen, diagnoosiin ja teollisuusnesteisiin. Olemme onnistuneesti kehittäneet keskipakosuodatinlaitteita, ultrasuodatus- ja mikrosuodatuskasetteja, virussuodattimia, TFF-järjestelmiä, syvyyssuodattimia, onttoja kuituja jne., jotka täyttävät täysin biofarmaseuttisten tuotteiden, soluviljelyn ja niin edelleen sovellusskenaariot. Kalvojamme ja kalvosuodattimiamme käytetään laajasti esisuodatuksen, mikrosuodatuksen, ultrasuodatuksen ja nanosuodatuksen tiivistämiseen, uuttamiseen ja erottamiseen. Monet tuotelinjamme pienestä kertakäyttöisestä laboratoriosuodatuksesta tuotannon suodatusjärjestelmiin, steriiliystestaukseen, fermentointiin, soluviljelyyn ja muuhun vastaavat testauksen ja tuotannon tarpeita. Guidling Technology odottaa innolla yhteistyötä kanssasi!